C. elegans Gonad Extrusion: En snabb dissekeringsteknik

Overview

Denna video beskriver en metod för att dissekera gonads från vuxna C. elegans hermafroditer, vilket resulterar i vävnader som är lämpliga för immunostaining och fluorescerande avbildning.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag ur Gervaise och Arur, Spatial and Temporal Analysis of Active ERK i C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (2016).

1. Dissekering av vuxna maskar för att få gonads

1. Välj 100 - 150 WT (N2) eller önskad genotyp av maskar i önskat och specifikt utvecklingsstadium (L1, L2, L3, L4, vuxen, etc.)i 100 μL M9-buffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
2. Fyll mikrocentrifugröret med 900 μL M9-buffert (se materialtabellen). Centrifugera rören vid 1 000 x g i en mikrocentrifug i 1 minut vid omgivningstemperatur.
3. Ta försiktigt bort 900 μL av M9-bufferten och kassera. Ta bort bufferten under ett dissekerande mikroskop för att säkerställa att maskarna inte tas bort av misstag.
4. Upprepa steg 1.2 - 1.3 två gånger till med färsk M9-buffert varje gång. Detta säkerställer att alla bakterier som transporterades över med maskarna effektivt tvättas bort.
5. Efter den slutliga tvätten ta bort 900 μL M9-buffert från röret och kassera.
6. Överför de återstående 100 μL M9-bufferten som innehåller 100- 150 maskar med en 200 μL-mikropipettespets till en platt bottenglasklocka. Se till att mikropipettespetsen skärs vid 10 μL-märket före användning. Att inte skära spetsen resulterar i klippning av maskarna.
7. Tillsätt 1 - 3 μL 0,1 M levamisole i glasklockan som innehåller maskarna i M9-buffert. Snurra försiktigt levamisole och M9 för att möjliggöra jämn blandning tills maskarna slutar röra sig.
   OBS: Levamisole lager kan lagras vid -20 °C för långtidslagring. Här, använd den högre koncentrationen av 1 - 3 mM än vad som har beskrivits i litteraturen23 av 0,2 - 0,25 mM levamisole för att få snabb förlust av rörlighet hos djuren. Om djuren fladdrar runt för länge i vätskesuspensionen kan de resulterande mönstren för dpERK i gonaderna vara varierande (på grund av stress eller brist på näring eller båda). Mer reproducerbara färgningsmönster har uppnåtts med 1-3 mM levamisole för dissekering.
8. Fäst två 25 G nålar på två 1 ml-sprutor (sprutans storlek spelar ingen roll, nålens mätare är kritisk). Placera en spruta i varje hand (bild 1).
9. Placera varje nål under och över varje mask under ett dissekerande mikroskop enligt figur 1 och placera ett fint snitt på masken nära den andra faryngala glödlampan i en saxliknande rörelse. Efter ett snitt i masken gå vidare till nästa djur tills alla djur i skålen har skurits minst en gång.
   OBS: Tänk på att steg 1.8 - 1.9 är tidskänsliga. Dissekera alla maskar i skålen på under fem minuter för ett reproducerbart dpERK-mönster. Längre dissekeringstider resulterar i att dpERK-signalen slås av, särskilt i zon 1. Justera antalet maskar per dissekeringsrunda (dvs.50 maskar jämfört med 150) om det behövs för att stanna inom den tilldelade tidsramen.
   1. Om en extruderad gonad inte är synlig under dissekeringen, försök inte ett annat snitt i samma djur. Vanligtvis kommer det bara att sjuta djuret och inte resultera i extrudering av gonad. Gå istället vidare till nästa djur. Maskar där gonaderna inte extruderar visas som sådana på bilderna som kommer att göras i avsnitt 6 och kan ignoreras under avbildning
      OBS: Genom alla dissekerings- och bearbetningssteg är det viktigt att komma ihåg att gonad kommer att förbli fäst vid kroppen / slaktkroppen. Tvinga inte gonad och kropp isär med nålen. Ofta kan en avvikande tår i gonadalvävnaden i ett försök att skära gonad från kroppen resultera i falsk antikroppssignal. Kroppen/slaktkroppen kan ignoreras under bildstegen, och endast gonadbilden. Dessutom kan tarmcellerna ibland också fungera som interna kontroller/somatiska kontroller för den antikropp som analyseras.

Figur 1: Demonstration av nålpositioner under dissekeringar. Vänster: Fotografi av en dissekering pågår. Höger: Nålpositioner med hänvisning till masken. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.