Detta protokoll är ett utdrag ur Gervaise och Arur, Spatial and Temporal Analysis of Active ERK i C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (2016).
1. Dissekering av vuxna maskar för att få gonads
- Välj 100 - 150 WT (N2) eller önskad genotyp av maskar i önskat och specifikt utvecklingsstadium (L1, L2, L3, L4, vuxen, etc.)i 100 μL M9-buffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Fyll mikrocentrifugröret med 900 μL M9-buffert (se materialtabellen). Centrifugera rören vid 1 000 x g i en mikrocentrifug i 1 minut vid omgivningstemperatur.
- Ta försiktigt bort 900 μL av M9-bufferten och kassera. Ta bort bufferten under ett dissekerande mikroskop för att säkerställa att maskarna inte tas bort av misstag.
- Upprepa steg 1.2 - 1.3 två gånger till med färsk M9-buffert varje gång. Detta säkerställer att alla bakterier som transporterades över med maskarna effektivt tvättas bort.
- Efter den slutliga tvätten ta bort 900 μL M9-buffert från röret och kassera.
- Överför de återstående 100 μL M9-bufferten som innehåller 100- 150 maskar med en 200 μL-mikropipettespets till en platt bottenglasklocka. Se till att mikropipettespetsen skärs vid 10 μL-märket före användning. Att inte skära spetsen resulterar i klippning av maskarna.
- Tillsätt 1 - 3 μL 0,1 M levamisole i glasklockan som innehåller maskarna i M9-buffert. Snurra försiktigt levamisole och M9 för att möjliggöra jämn blandning tills maskarna slutar röra sig.
OBS: Levamisole lager kan lagras vid -20 °C för långtidslagring. Här, använd den högre koncentrationen av 1 - 3 mM än vad som har beskrivits i litteraturen23 av 0,2 - 0,25 mM levamisole för att få snabb förlust av rörlighet hos djuren. Om djuren fladdrar runt för länge i vätskesuspensionen kan de resulterande mönstren för dpERK i gonaderna vara varierande (på grund av stress eller brist på näring eller båda). Mer reproducerbara färgningsmönster har uppnåtts med 1-3 mM levamisole för dissekering.
- Fäst två 25 G nålar på två 1 ml-sprutor (sprutans storlek spelar ingen roll, nålens mätare är kritisk). Placera en spruta i varje hand (bild 1).
- Placera varje nål under och över varje mask under ett dissekerande mikroskop enligt figur 1 och placera ett fint snitt på masken nära den andra faryngala glödlampan i en saxliknande rörelse. Efter ett snitt i masken gå vidare till nästa djur tills alla djur i skålen har skurits minst en gång.
OBS: Tänk på att steg 1.8 - 1.9 är tidskänsliga. Dissekera alla maskar i skålen på under fem minuter för ett reproducerbart dpERK-mönster. Längre dissekeringstider resulterar i att dpERK-signalen slås av, särskilt i zon 1. Justera antalet maskar per dissekeringsrunda (dvs.50 maskar jämfört med 150) om det behövs för att stanna inom den tilldelade tidsramen.
- Om en extruderad gonad inte är synlig under dissekeringen, försök inte ett annat snitt i samma djur. Vanligtvis kommer det bara att sjuta djuret och inte resultera i extrudering av gonad. Gå istället vidare till nästa djur. Maskar där gonaderna inte extruderar visas som sådana på bilderna som kommer att göras i avsnitt 6 och kan ignoreras under avbildning
OBS: Genom alla dissekerings- och bearbetningssteg är det viktigt att komma ihåg att gonad kommer att förbli fäst vid kroppen / slaktkroppen. Tvinga inte gonad och kropp isär med nålen. Ofta kan en avvikande tår i gonadalvävnaden i ett försök att skära gonad från kroppen resultera i falsk antikroppssignal. Kroppen/slaktkroppen kan ignoreras under bildstegen, och endast gonadbilden. Dessutom kan tarmcellerna ibland också fungera som interna kontroller/somatiska kontroller för den antikropp som analyseras.
Figur 1: Demonstration av nålpositioner under dissekeringar. Vänster: Fotografi av en dissekering pågår. Höger: Nålpositioner med hänvisning till masken. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
