C. 예르간 먹이RNAi 도금: 대장균에서 표적 dsRNA 발현을 유도하는 기술

Overview

이 비디오는 C. elegans에서 RNAi 처리의 뒤에 원리를 설명하고 형질 전환벌레 긴장에 있는 lin-35를 노크하는 프로토콜을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 Kolundzic, 외,RNAi및 열 충격 유도 전사 인자 발현의 응용 프로그램에서 발췌하여 생식세포를 C. 엘레건의뉴런으로 재프로그래밍하기 위해, J. Vis. Exp. (2018). 

1. 솔루션 준비
   1. NGM-아가 플레이트 (1 L)
      1. NaCl 3g, 펩톤 미디어 2.5g(예: 바토-펩톤) 및 20g의 한고를 추가합니다. 오토클레이브 후 콜레스테롤 1mL(95% EtOH 재고 5mg/mL), M MgSO₄mML 1mL, M CaCl2 1mL 1mL, M K2PO_4m25mL, 앰포테린 B 1mL(2.5 mg/mL 스톡)을 추가합니다.
   2. NGM-아가 RNAi 플레이트 (1 L)
      1. NaCl 3g, 펩톤 미디어 2.5g, 한천 20g을 추가합니다. 오토클레이빙 추가 후, 콜레스테롤 1mL(95% EtOH 재고 5mg/mL), M MgSO_4mL 1mL, M CaCl2 1mL, 1M K₂PO_4,앰포테린 B 1mL(2.5 mg/mL 스톡), 1mMIpTG, 1mL(1mL) 1mL(1mL).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. 펩톤 미디어 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 20g, 1M Tris pH 8.0 10mL를 추가합니다. H₂O를 1 L에 추가합니다. 오토클레이브 후 50 mg/mL 카베니실린1mL과 5 mg/mL 테트라사이클린의 2.5mL를 추가하십시오.
   4. LB 미디엄 (1 L)
      1. 펩톤 미디어 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, M Tris pH 8.0 10mL를 추가합니다. H₂O를 1 L에 추가합니다. 오토클레이브 후 50 mg/mL 카베니실린1mL을 추가하십시오.
   5. M9 버퍼 (1 L)
      1. Na₂HPO_4,KH₂PO₄3g, NaCl 5g, 젤라틴 50 mg의 6.0 g를 추가합니다. 사용 하기 전에, 추가 1 mL 의 1 M MgSO_4.
   6. 표백 용액 (10mL)
      1. NaClO 1mL, 5N NaOH 2mL를 추가합니다. 10mL에 H2O를 추가합니다.
2. RNAi 플레이트 준비
   참고: C. elegans는 일반적으로 선충 성장 중간 향(NGM-Agar)의 7.5mL를 포함하는 6cm 페트리 플레이트에 대한 실험실에서 배양됩니다. 이 프로토콜은 15°C에 보관된 웜에 최적화되어 있습니다. NGM으로 플레이트를 준비하려면 표준 멸균 기술을 사용하여 곰팡이 및 세균 오염을 방지하십시오. 다음은 RNAi에 대한 시약으로 보충된 NGM 플레이트를 준비하는 프로토콜이다.
   1. 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈라크토피라노사이드(IPTG) 및 50 μg/mL 카베니실린을 포함하는 6cm NGM-Agar RNAi 플레이트를 준비한다. 어두운 12의 실온에서 24 - 48 시간 동안 건조하게하십시오.
      1. 어둠 속에서 RNAi 플레이트를 4 °C로 유지하십시오. 14일 이상 인 경우에는 사용하지 마십시오.
   2. 50 μg/mL 카베니실린 및 12.5μg/mL 테트라사이클린을 함유한 LB-agar 플레이트에 사용 가능한 RNAi 라이브러리에서 냉동 글리세롤 스톡으로부터 린-53 유전자 DNA 서열을 함유한 L4440 플라스미드를 함유한 RNAi박테리아(Escherichia coli HT115)클론을 선택한다. 하룻밤 사이에 37°C에서 박테리아를 성장시다. 이 클론은 박테리아에서 lin-53 dsRNA의 IPTG 의존적인 생산을 허용합니다.
      1. 추가적으로, 빈 벡터 대조군으로서 어떤 유전자 서열없이 L4440 플라스미드를 포함하는 RNAi 박테리아를 성장시다.
   3. 다음 날, lin-53 또는 빈 벡터 LB-agar 플레이트에서 단일 콜로니를 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 선택하고 50 μg/mL 카베니실린으로 보충된 액체 LB 배지 2mL를 포함하는 별도의 배양 튜브로 접종합니다. 0.6 -0.8의 600 nm에서 광학 밀도 (OD)에 도달 할 때까지 37 °C에서 하룻밤 문화를 성장시다. 분광계를 사용하여 OD를 측정합니다.
      주의: 액체 LB 매체는 글리세롤 주식에서 박테리아를 줄무늬에 사용되는 LB-agar 플레이트와 는 대조적으로 테트라사이클린을 함유해서는 안되며, 이는 먹이기 동안 테트라사이클린을 함유하여 RNAi 효율이 감소하기 때문에.
   4. 멀티 파이프를 사용하여 각 세균 배양(lin-53 또는 빈 벡터)의 500 μL을 6cm NGM-Agar RNAi 플레이트에 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 밤새 닫은 뚜껑이 있는 플레이트를 배양하여 건조시다. 이 시간 동안, NGM 플레이트내의 IPTG는 박테리아에서 dsRNA의 생산을 유도할 것이다.
      1. 실험당 세균 배양당 최소 3플레이트를 사용하십시오. 이렇게 하면 각 실험에 대해 3개의 기술 복제가 제공됩니다.
   • 말린 NGM-한천 RNAi 플레이트를 어둠 속에서 4°C에 박테리아와 함께 최대 2주 동안 보관하십시오.
3. C. 예레간 스트레인 BAT28의 준비
4. 15°C에서 표준 NGM-Agar 플레이트를 이용하여 OP50 박테리아에대해 [hsp-16.2prom:che-16.2prom:che-16.2prom:]및 ntIs1[gcy-5prom:gfp] 및 ntIs1 [gcy-5prom:gfp]및 ntIs1을포함하는 웜 균주 BAT28을 유지한다. 
   참고: 선충 문화에 대한 자세한 프로토콜을 보려면 참조하십시오. rol-6 (su1006)은 일반적인 압연 운동을 일으키는 지배적 인 진상선 및 일반적으로 사용되는 페노티픽 주입 마커^{(16)입니다.} 그것은 hsp-16.2prom을추적하기 위해 otIs305 유전자에서 사용됩니다 ::che-1 .
   1. HSp-16.2prom::che-1 트랜스진의 사전 활성화를 방지하기 위해 BAT28 균주를 항상 15°C로 유지한다. 가능한 한 균주를 처리하면서 15 °C 이상의 온도에 노출을 줄입니다.
5. 벌레를 나이 동기화하려면 표백 기술을 사용합니다.
   1. 900 μL M9 버퍼를 사용하여 BAT28의 성인과 계란을 포함하는 6cm NGM-Agar 플레이트를 씻어 내시다. 펠릿 웜은 900 x g에서 원심분리하여 1분 동안 합니다. 상부체를 제거합니다.
   2. 0.5 - 1 mL의 표백 용액을 추가하고 성인 벌레가 터지기 시작할 때까지 튜브를 약 1 분 동안 흔들어 줍니다. 표준 스테레오현미경을 사용하여 모니터합니다.
   3. 펠릿 웜은 900 x g에서 원심분리하여 1분 동안 합니다. 상부체를 제거합니다.
   4. 웜 펠릿을 M9 버퍼 800 μL을 추가하고 900 x g의 원심분리를 추가하여 웜 펠릿을 3번 세척합니다.
   5. OP50 박테리아로 시드된 신선한 NGM 플레이트에 세척된 계란을 놓습니다. 그들은 L4 단계 (약 4 일)에 도달 할 때까지 15 °C에서 OP50 박테리아에 표백 된 인구를 성장. L4 애벌레는 표준 스테레오 현미경을 사용하여 웜의 복부 측면을 따라 약 절반의 흰색 패치에 의해 인식될 수 있다.
      참고: 린-53의고갈시 신경 변환 표현형으로 세균 세포를 달성하기 위해서는 부모 세대(P0)에서 고갈될 필요가 있다. 변환 표현형에 대한 점수는 다음 세대(filial generation F1)에서 수행된다. P0에 이미 고갈된 lin-53을 달성하기 위해 L4 동물은 RNAi를 받게 됩니다.
6. 백금 와이어를 사용하여 복제당 50L4 단계 웜을 박테리아가 포함되어 있지 않고 벌레가 전달된 OP50 박테리아에서 멀리 이동하도록 하는 NGM 플레이트로 수동으로 전송합니다. 벌레가 접시에서 약 5분 동안 움직이도록 합니다. NGM-Agar RNAi 플레이트에서 박테리아를 사용 하 여 이전에 lin-53 RNAi 박테리아와 시드 (또는 빈 벡터 제어) 각 RNAi 플레이트로 전송.
   1. OP50 박테리아를 실제 RNAi 플레이트로 옮기지 마십시오. 15°C 이상의 온도에 대한 스트레인의 노출 시간을 최소화하기 위해 빠르게 작업합니다.
7. 15°C에서 NGM-Agar RNAi 플레이트의 웜을 약 7일 동안 배양하여 웜의 F1 자손이 L3 – L4 단계에 도달할 때까지 한다. 그들은 F1 자손보다 크고 두껍기 때문에 P0 동물과 명확하게 분리 될 수 있습니다.
   1. F1 자손 벌레가 도 1에도시된 바와 같이 돌출외부(pvul) 표현형을 보이는지 여부를 표준 스테레오현미경으로 시각적으로 확인한다. 린-53에 대한 RNAi는 흉골 효과를 가지고 있으며 lin-53에 대한 RNAi가 성공했는지 여부를 평가하는 데 사용할 수있는 pvul 표현형을 일으킵니다.
      참고:  lin-53에 대한 RNAi는 또한 F1 배아의 치사성을 일으킬 수 있습니다. 이 효과는 동물이 L3 – L4 단계에 도달하기 전에 플레이트가 15 °C보다 높은 정도에 노출되면 증가합니다. 죽은 배아는 체포 된 개발과 부화의 부족에 의해 인식 될 수있다.
   2. IPTG는 빛에 민감하기 때문에 어둠 속에서 플레이트를 배양합니다.

Representative Results

그림 1: 린-53에 대한 RNAi에 의해 발생 Pvul 표현형. (상단) L4/젊은 성인 단계 F1 자손 웜의 DIC 사진 제어 또는 lin-53 RNAi 치료 어머니에서 파생 된. 스케일 바 = 20 μm. (아래) lin-53 RNAi로 처리된 동물은 돌출된외음부(pvul)표현형(블랙 애로우 헤드)을 표시한다. pvul 표현형은 린-53에 대한 RNAi가 성공했다는 것을 확인합니다. 스케일 바 = 20 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654