C.エレガンスの授乳のためのRNAiめっき:大腸菌における標的dsRNA発現を誘導する技術

Overview

このビデオは 、C.エレガンス におけるRNAi治療の原理を説明し、トランスジェニックワーム株で lin-35 をノックダウンするプロトコルを示しています。

Protocol

このプロトコルは、Kolundzic、他、RNAiおよび熱ショック誘発転写因子発現の適用から抜粋され、生殖細胞をC.エレガンスのニューロンに再プログラムする、 J. Vis. Exp.(2018). 

1. ソリューションの準備
   1. NGM-寒天プレート (1 L)
      1. NaClの3g、ペプトン培地2.5g(例えば、バクト・ペプトン)、および20gの寒天を加える。オートクレーブ処理後、コレステロール1 mL(95%EtOHストック5 mg/mL)、1 M MgSO₄の1 mL、1 M CaCl2の1 mL、1 M K2PO₄の25 mL、およびアンホテリシンB(2.5 mg/mLストック)を1 mL加えます。
   2. NGM-寒天RNAiプレート (1 L)
      1. NaClの3g、ペプトン培地2.5g、寒天20gを加えます。添加後、1 mLのコレステロール(95%EtOHストック5mg/mL)、1 MMgSO₄の1mL、1M CaCl2の1 mL、1 M K₂PO₄の25 mL、アンホテリシンBの1 mL(2.5mg/mLストック)、1 mLの1 ML
   3. LB-寒天 (1 L)
      1. ペプトン培地10g、酵母エキス5g、NaCl5g、寒天20g、1MトリスpH8.0の10mLを加える。H2Oを1 Lに加える。オートクレーブ処理後、50 mg/mLカルベニシリン1 mL、5 mg/mLテトラサイクリン2.5 mLを加えます。
   4. LB ミディアム (1 L)
      1. ペプトン培地10g、酵母エキス5g、NaCl5g、1MトリスpH 8.0の10mLを加えます。H2Oを1 Lに加える。オートクレーブ処理後、50 mg/mL カルベニシリンを 1 mL加えます。
   5. M9 バッファ (1 L)
      1. Na₂HPO₄の6.0 g、KH_2PO4の3g、NaClの5g、および50mgのゼラチンを加えます。使用前に、1 M MgSO₄の 1 mL を追加します。
   6. 漂白液(10mL)
      1. NaClOを1 mL、5 N NaOHの2 mLを加えます。H2Oを10 mLに加えます。
2. RNAIプレートの製造
   注: C.エレガンスは、典型的には、ネマトード成長培地寒天(NGM-寒天)の7.5 mLを含む6cmペトリプレート上の実験室で培養される。このプロトコルは、15 °Cに保たれているワームに最適化されています。 NGM でプレートを準備するには、標準的な滅菌技術を使用して、真菌および細菌汚染を防止します。RNAi用の試薬を補充したNGMプレートを調製するためのプロトコルは以下の通りです。
   1. 1 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)と50 μg/mLカルベニシリンを含む6cm NGM-寒天RNAiプレートを準備します。暗い12の室温で24〜48時間乾燥させてください。
      1. 暗い状態で4°CにRNAiプレートを保管してください。14日より古い場合は使用しないでください。
   2. 3つのストレーシングパターンを使用して、50μg/mLカルベニシリンおよび12.5 μg/mLテトラクリンを含むLB寒天プレート上の凍結したグリセロールストックから、リン53遺伝子DNA配列を含むL4440遺伝子DNA配列を含むRNAi細菌(大腸菌HT115)クローンを選択します。一晩で37°Cで細菌を成長させます。このクローンは、細菌中のリン53 dsRNAのIPTG依存的な生産を可能にする。
      1. さらに、L4440プラスミドを含むRNAi細菌を、空のベクターコントロールとして遺伝子配列を含まない増殖させる。
   3. 翌日、200 μL ピペットチップを使用してlin-53または空のベクターLB-寒天プレートから単一コロニーを選び、50 μg/mLカルベニシリンを添加した液体LB培地2 mLを含む別の培養チューブにそれぞれを接種します。彼らは0.6 - 0.8の600 nmで光学密度(OD)に達するまで、37 °Cで一晩培養を成長させます。分光光度計を用いてODを測定する。
      注意:液体LB培地は、供給中にテトラサイクリンを含むことでRNAi効率が低下するため、グリセロールストックから細菌をストリークするために使用されるLB寒天プレートとは対照的にテトラサイクリンを含んではなりません。
   4. 各細菌培養物(lin-53または空のベクター)を、マルチピペットを使用して6cm NGM-寒天RNAiプレートに500 μL添加します。暗い状態で一晩閉じた蓋を持つプレートを乾燥させます。この間、NGMプレート中のIPTGは、細菌中のdsRNAの産生を誘導する。
      1. 実験ごとに細菌培養ごとに少なくとも3つのプレートを使用してください。これにより、各実験に対して 3 つの技術的な複製が提供されます。
   • 乾燥したNGM寒天RNAiプレートを4°Cの細菌で暗闇の中で最大2週間保管してください。
3. C.エレガンスストレインBAT28の調製
4. トランス遺伝子otIs305を含むワーム株BAT28を維持する[hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] およびntIs1 [gcy-5prom::gfp]標準NGM-寒天プレートを使用してOP50細菌に15°Cで。
   注:線虫培養に関する詳細なプロトコルについては、を参照してください。rol-6(su1006)は、支配的なアレーレであり、典型的な転がり運動を引き起こす一般的に使用される手引き注射マーカー¹⁶である。これは、hsp-16.2prom::che-1を追跡するためにotIs305トランスジーンで使用されています。
   1. hsp-16.2prom::che-1トランスジーンの慎重な活性化を防ぐために、BAT28 株を常に 15 °C に保ちます。できるだけ歪みを処理しながら、15°Cより高い温度への暴露を減らします。
5. ワームを老化させるには、漂白技術を使用します。
   1. 900 μL M9 バッファーを使用して、BAT28 の成人と卵を含む 6 cm NGM-寒天プレートを洗い流します。ペレットワームは、900xgで1分間遠心分離機を行う。上清を取り除く。
   2. 漂白液の0.5 〜1 mLを追加し、成虫が破裂し始めるまで約1分間チューブを振ります。標準的な実体顕微鏡を使用して監視します。
   3. ペレットワームは、900xgで1分間遠心分離機を行う。上清を取り除く。
   4. M9バッファーと遠心分離機を800 μL 900 x gで加えて、ワームペレットを3回洗浄します。
   5. OP50細菌を播種した新鮮なNGMプレートに洗浄した卵を置きます。彼らはL4段階(約4日)に達するまで15 °CでOP50細菌の漂白集団を成長させます。L4幼虫は、標準的な実体顕微鏡を用いて、ワームの腹側に沿ってほぼ半ばに白いパッチで認識することができる。
      注:lin-53の枯渇時に生殖細胞をニューロン変換表現型に達成するためには、親の世代(P0)で枯渇する必要がある。変換表現型のスコアリングは、以下の世代(親膜生成F1)で行われる。P0に既に枯渇したリン53を達成するために、L4動物はRNAiを受ける。
6. 白金線を使用して複製ごとに50 L4ステージワームを細菌を含まないNGMプレートに手動で移し、ワームは転写されたOP50細菌から離れさせます。ワームは、約5分間プレート上を移動してみましょう。リン53 RNAi細菌(または空のベクターコントロール)で播種したNGM-寒天RNAiプレートの細菌を使用して、それぞれのRNAiプレートに移ります。
   1. 実際のRNAiプレートにOP50バクテリアを移すことを避けてください。15°Cより高い温度への歪みの暴露時間を最小限に抑えるために速く働きます。
7. 15°CのNGM-寒天RNAiプレート上のインキュベートワームは、ワームのF1プロゲニーがL3 - L4段階に達するまで約7日間行われます。彼らはF1子孫よりも大きく、厚いので、彼らは明らかにP0動物から分離することができます。
   1. 図1に示すように、F1前立性ワームが突出した外陰部(pvul)表現型を示すかどうかを標準の実体顕微鏡で視覚的に確認する。lin-53に対するRNAiは多発性作用を有し、lin-53に対するRNAiが成功したかどうかを評価するために使用することができるpvul表現型を引き起こす。
      注: lin-53に対するRNAiはまた、F1胚の致死性を引き起こす可能性がある。この効果は、動物がL3 - L4段階に達する前にプレートが15°Cよりも高い度にさらされると増加します。死んだ胚は、逮捕された発達と孵化の欠如によって認識することができる。
   2. IPTGは光感受性であるため、暗い中でプレートをインキュベートします。

Representative Results

図1:リン-53に対するRNAiによって引き起こされるPvul表現型。(トップ)L4/ヤングアダルトステージF1子孫ワームのDIC画像は、コントロールまたはlin-53 RNAi治療された母親に由来する。スケールバー= 20 μm. (下部) lin-53 RNAi で処理された動物は、突出した外陰部(pvul)表現型(黒矢印ヘッド)を表示します。pvul表現型はlin-53に対するRNAiが成功したことを確認する。スケールバー= 20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654