Placage RNAi pour l’alimentation de C. elegans : Une technique pour induire l’expression cible dsRNA dans E. coli

Overview

Cette vidéo décrit les principes derrière le traitement RNAi dans C. elegans et démontre un protocole pour abattre lin-35 dans une souche de ver transgénique.

Protocol

Ce protocole est extrait de Kolundzic, et coll., Application of RNAi and Heat-shock-induit Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Préparation des solutions
   1. Plaques NGM-Agar (1 L)
      1. Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone (p. ex., Bacto-Peptone) et 20 g d’agar. Après autoclaving, ajouter 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans 95% de stock EtOH), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO₄, et 1 mL d’amphotericine B (2,5 mg/mL de stock).
   2. Plaques NGM-Agar RNAi (1 L)
      1. Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone et 20 g d’agar. Après autoclaving ajouter, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL en 95% stock EtOH), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K₂PO_4,1 mL d’amphotericine B (2,5 mg/mL de bouillon), 1 mL de 1 M IPTG et 1 mL de carbenicilline (50 mg/mL).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Ajouter 10 g de peptone, 5 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl, 20 g d’agar, 10 mL de 1 M Tris pH 8,0. Ajouter H₂O à 1 L. Après autoclaving, ajouter 1 mL de 50 mg/mL de carbenicilline et 2,5 mL de 5 mg/mL de tétracycline.
   4. LB Moyen (1 L)
      1. Ajouter 10 g de peptone, 5 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl et 10 mL de 1 M Tris pH 8,0. Ajouter H₂O à 1 L. Après autoclaving, ajouter 1 mL de 50 mg/mL de carbenicilline.
   5. Tampon M9 (1 L)
      1. Ajouter 6,0 g de Na₂HPO₄, 3 g de KH₂PO_4,5 g de NaCl et 50 mg de gélatine. Avant utilisation, ajouter 1 mL de 1 M MgSO₄.
   6. Solution de blanchiment (10 mL)
      1. Ajouter 1 mL de NaClO et 2 mL de 5 N NaOH. Ajouter H2O à 10 mL.
2. Préparation des plaques RNAi
   REMARQUE: C. elegans est généralement cultivé en laboratoire sur des plaques petri de 6 cm contenant 7,5 mL d’agar moyen de croissance nématode (NGM-Agar). Ce protocole est optimisé pour les vers maintenus à 15 °C. Pour préparer des plaques avec NGM, utilisez des techniques stériles standard pour prévenir la contamination fongique et bactérienne. Ce qui suit est le protocole pour préparer les plaques NGM complétées par des réaccéléments pour RNAi.
   1. Préparer des plaques NGM-Agar RNAi de 6 cm contenant 1 mM d’isopropylique β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et 50 μg/mL de carbenicilline. Laissez-les sécher pendant 24 - 48 h à température ambiante dans l’obscurité¹².
      1. Gardez les plaques RNAi à 4 °C dans l’obscurité. Ne pas utiliser si plus de 14 jours.
   2. Sélectionnez le clone de la bactérie RNAi (Escherichia coli HT115) contenant le plasmide L4440 avec la séquence d’ADN génétique lin-53 du stock de glycérol congelé de la bibliothèque RNAi disponible sur les plaques de LB-agar contenant 50 μg/mL de carbenicilline et 12,5 μg/mL de tetracycline en utilisant le modèle de stries en trois phases. Faire croître la bactérie à 37 °C pendant la nuit. Ce clone permet la production dépendante de l’IPTG de lin-53 dsRNA dans les bactéries.
      1. En outre, cultiver des bactéries RNAi qui contiennent le plasmide L4440 sans aucune séquence génétique comme la lutte antivectorielle vide.
   3. Le lendemain, choisissez une seule colonie à partir de plaques de lin-53 ou de vecteurs vides LB-agar à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL et inoculez chacune d’entre elles dans un tube de culture distinct contenant 2 mL de lb liquide moyen complété avec 50 μg/mL de carbenicilline. Cultiver des cultures du jour au lendemain à 37 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique (OD) à 600 nm de 0,6 à 0,8. Mesurez l’OD à l’aide d’un spectrophotomètre.
      MISE EN GARDE : Les supports liquides de LB ne devraient pas contenir la tétracycline contrairement à la plaque de LB-agar utilisée pour strier les bactéries du stock de glycérol, puisque l’inclusion de la tétracycline pendant l’alimentation mène à une efficacité diminuée de RNAi.
   4. Ajouter 500 μL de chaque culture bactérienne(lin-53 ou vecteur vide) aux plaques NGM-Agar RNAi de 6 cm à l’aide d’une multipipette. Incuber les assiettes avec un couvercle fermé toute la nuit à température ambiante dans l’obscurité pour sécher. Pendant ce temps, l’IPTG dans les plaques NGM va induire la production de dsRNA dans les bactéries.
      1. Utilisez au moins 3 plaques par culture bactérienne par expérience. Cela fournira 3 répliques techniques pour chaque expérience.
   • Conserver les plaques RNAi séchées de NGM-agar avec des bactéries à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à deux semaines.
3. Préparation de C. elegans Strain BAT28
4. Maintenir la souche de ver BAT28 contenant les transgènes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6 (su1006)] et ntIs1 [gcy-5prom::gfp]sur les bactéries OP50 utilisant des plaques NGM-Agar standard à 15 °C.
   REMARQUE: Pour un protocole détaillé sur la culture Nématode, voir. Le rol-6 (su1006) est un allèle dominant et couramment utilisé marqueur d’injection phénotypique¹⁶ qui provoque le mouvement de roulement typique. Il est utilisé dans le transgène otIs305 pour suivre hsp-16.2prom::che-1.
   1. Maintenez la souche BAT28 à 15 °C en tout temps afin d’empêcher l’activation précautious du transgène hsp-16.2prom::che-1. Réduisez l’exposition à des températures supérieures à 15 °C tout en manipulant la souche autant que possible.
5. Pour synchroniser les vers, utilisez la technique de blanchiment.
   1. Laver les plaques NGM-Agar de 6 cm contenant des adultes et des œufs de BAT28 à l’aide d’un tampon M9 de 900 μL. Vers à granulés en centrifugant à 900 x g pendant 1 min. Retirer le surnatant.
   2. Ajouter 0,5 à 1 mL de solution de blanchiment et secouer le tube pendant environ 1 min jusqu’à ce que les vers adultes commencent à éclater. Moniteur à l’aide d’un stéréomicroscope standard.
   3. Vers à granulés en centrifugant à 900 x g pendant 1 min. Retirer le surnatant.
   4. Lavez la pastille de ver 3 fois en ajoutant 800 μL de tampon M9 et en centrifugant à 900 x g.
   5. Déposer les œufs nettoyés sur des plaques NGM fraîches épépinées avec des bactéries OP50. Faire croître une population blanchie sur la bactérie OP50 à 15 °C jusqu’à ce qu’elle atteigne le stade L4 (environ 4 jours). Les larves de L4 peuvent être reconnues par une tache blanche à peu près à mi-chemin le long du côté ventral du ver à l’aide d’un stéréomicroscope standard.
      REMARQUE: Pour atteindre la cellule germinale au phénotype de conversion de neurone lors de l’épuisement du lin-53,il doit être épuisé dans la génération parentale (P0). La notation pour le phénotype de conversion est entreprise dans la génération suivante (génération filiale F1). Pour atteindre l’épuisement lin-53 déjà dans le P0, les animaux L4 sont soumis à RNAi.
6. Transférez manuellement 50 vers de stade L4 par réplique à l’aide d’un fil de platine vers une plaque NGM qui ne contient aucune bactérie et laisse les vers s’éloigner des bactéries OP50 transférées. Laissez les vers se déplacer sur la plaque pendant environ 5 minutes. Utilisez des bactéries des plaques NGM-Agar RNAi précédemment ensemencées avec des bactéries lin-53 RNAi (ou contrôle vectoriel vide) pour les transférer dans les plaques RNAi respectives.
   1. Évitez de transférer les bactéries OP50 dans les plaques RNAi réelles. Travaillez rapidement pour réduire au minimum le temps d’exposition de la souche à des températures supérieures à 15 °C.
7. Incuber les vers sur les plaques NGM-Agar RNAi à 15 °C pendant environ 7 jours jusqu’à ce que la descendance F1 des vers atteigne le stade L3 – L4. Ils peuvent être clairement séparés des animaux P0 car ils sont plus gros et plus épais que la descendance F1.
   1. Vérifiez visuellement sous un stéréomicroscope standard si les vers de descendance F1 montrent le phénotype saillant de vulve(pvul)comme indiqué dans la figure 1. RNAi contre lin-53 a des effets pléiotropes et provoque le phénotype pvul qui peut être utilisé pour évaluer si RNAi contre lin-53 a été couronnée de succès.
      REMARQUE:  RnAi contre lin-53 peut également causer la létalité des embryons de F1. Cet effet augmente si les plaques sont exposées à des degrés supérieurs à 15 °C avant que les animaux n’atteignent le stade L3 – L4. Les embryons morts peuvent être reconnus par le développement arrêté et l’absence d’éclosion.
   2. Incuber les plaques dans l’obscurité puisque l’IPTG est sensible à la lumière.

Representative Results

Figure 1 : Phénotype de Pvul provoqué par RNAi contre lin-53. (En haut) Image DIC des vers de descendance F1 de stade L4/jeune adulte dérivés de la lutte ou des mères traitées par lin-53 RNAi. Barres d’échelle = 20 μm. (Bottom) Les animaux traités avec lin-53 RNAi affichent la vulve saillante(pvul)phénotype (têtes de flèches noires). Le phénotype de pvul confirme que RNAi contre lin-53 a été réussi. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654