RNAi Chapeamento para C. elegans Alimentação: Uma Técnica para Induzir a Expressão de DSRNA Alvo em E. coli

Overview

Este vídeo descreve os princípios por trás do tratamento RNAi em C. elegans e demonstra um protocolo para derrubar lin-35 em uma cepa de verme transgênico.

Protocol

Este protocolo é extraído de Kolundzic, et al, Aplicação da RNAi e Expressão do Fator de Transcrição Induzida por Choque térmico para reprogramar células germinativas para neurônios em C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparação da solução
   1. Placas NGM-Agar (1 L)
      1. Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone media (por exemplo, Bacto-Peptone) e 20 g de ágar. Após autoclavagem, adicione 1 mL de colesterol (5 mg/mL em estoque etoh de 95%), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO₄e 1 mL de anfotérico B (2,5 mg/mL).
   2. Placas NGM-Agar RNAi (1 L)
      1. Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone media e 20 g de ágar. Após a ação de autoclavagem, 1 mL de colesterol (5 mg/mL em estoque etoh 95), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K₂PO₄, 1 mL de anfotericina B (2,5 mg/mL), 1 mL de 1 M IPTG e 1 mL de carbenicilina (50 mg/mL).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Adicione 10 g de peptone de mídia, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, 20 g de ágar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Adicione H₂O a 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de carbenicilina de 50 mg/mL e 2,5 mL de tetraciclina de 5 mg/mL.
   4. Meio LB (1 L)
      1. Adicione 10 g de peptone media, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, e 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Adicione H₂O a 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de carbenicilina de 50 mg/mL.
   5. Tampão M9 (1 L)
      1. Adicione 6,0 g de Na₂HPO₄, 3 g de KH₂PO₄, 5 g de NaCl e 50 mg de gelatina. Antes do uso, adicione 1 mL de 1 M MgSO₄.
   6. Solução de branqueamento (10 mL)
      1. Adicione 1 mL de NaClO e 2 mL de 5 N NaOH. Adicione H2O a 10 mL.
2. Preparação de Placas RNAi
   NOTA: C. elegans é tipicamente cultivado em laboratório em placas de Petri de 6 cm contendo 7,5 mL de ágar médio de crescimento nematode (NGM-Agar). Este protocolo é otimizado para worms mantidos a 15 °C. Para preparar placas com NGM, use técnicas estéreis padrão para evitar contaminação fúngica e bacteriana. A seguir, o protocolo para preparar placas de NGM complementadas com reagentes para RNAi.
   1. Prepare placas NGM-Agar RNAi de 6 cm contendo 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 50 μg/mL carbenicillin. Deixe-os secar por 24 – 48 h em temperatura ambiente no escuro¹².
      1. Mantenha as placas RNAi a 4 °C no escuro. Não use se tiver mais de 14 dias.
   2. Selecione o clone rnai(Escherichia coli HT115) contendo o plasmídeo L4440 com a sequência de DNA genético lin-53 do estoque de glicerol congelado da biblioteca RNAi disponível em placas LB-ágar contendo 50 μg/mL carbenicillin e 12,5 μg/mL tetraciclina usando o padrão de trifálquica. Cresça as bactérias a 37 °C durante a noite. Este clone permite a produção dependente de IPTG de lin-53 dsRNA na bactéria.
      1. Além disso, cultivar bactérias RNAi que contêm o plasmídeo L4440 sem qualquer sequência genética como o controle de vetor vazio.
   3. No dia seguinte, escolha uma única colônia de placas lin-53 ou de vetor vazio LB-ágar usando uma ponta de pipeta de 200 μL e inocula cada uma delas em um tubo de cultura separado contendo 2 mL de líquido LB médio complementado com 50 μg/mL carbenicillin. Cultivar culturas durante a noite a 37 °C até atingir uma densidade óptica (OD) a 600 nm de 0,6 – 0,8. Meça o OD usando um espectrofotômetro.
      ATENÇÃO: A mídia líquida LB não deve conter tetraciclina em contraste com a placa LB-ágar usada para a estria do estoque de glicerol, uma vez que a inclusão da tetraciclina durante a alimentação leva a uma diminuição da eficiência rnai.
   4. Adicione 500 μL de cada cultura bacteriana(lin-53 ou vetor vazio) a placas NGM-Agar RNAi de 6 cm usando um multipipette. Incubar placas com tampa fechada durante a noite à temperatura ambiente no escuro para secar. Durante este tempo, o IPTG nas placas de GNM induzirá a produção de dsRNA na bactéria.
      1. Use pelo menos 3 placas por cultura bacteriana por experimento. Isso fornecerá 3 réplicas técnicas para cada experimento.
   • Armazene placas rnai de NGM-ágar seco com bactérias a 4 °C no escuro por até duas semanas.
3. Preparação de C. elegans Strain BAT28
4. Mantenha a cepa de vermes BAT28 contendo os transgêmulos otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] e ntIs1 [gcy-5prom::gfp] em bactérias OP50 usando placas padrão NGM-Agar a 15 °C.
   NOTA: Para um protocolo detalhado sobre a cultura Nematode, consulte. O rol-6(su1006) é um alelo dominante e comumente usado marcador de injeção fenotípica¹⁶ que causa o movimento típico de rolamento. É usado no transgene otIs305 para rastrear hsp-16.2prom::che-1.
   1. Mantenha a cepa BAT28 a 15 °C o tempo todo, a fim de evitar a ativação precatória do hsp-16.2prom::che-1 transgene. Reduza a exposição a temperaturas superiores a 15 °C enquanto manuseia a cepa o máximo possível.
5. Para sincronizar a idade dos vermes, use a técnica de branqueamento.
   1. Lave as placas NGM-Agar de 6 cm contendo adultos e ovos de BAT28 usando tampão M9 de 900 μL. Vermes de pelotas por centrifugação a 900 x g por 1 min. Remova o supernatante.
   2. Adicione 0,5 – 1 mL de solução de branqueamento e agite o tubo por aproximadamente 1 minuto até que os vermes adultos comecem a estourar. Monitore usando um estereótipo padrão.
   3. Vermes de pelotas por centrifugação a 900 x g por 1 min. Remova o supernatante.
   4. Lave a pelota de worm 3 vezes adicionando 800 μL de tampão M9 e centrifugando a 900 x g.
   5. Coloque os ovos limpos em placas de GNM frescos semeadas com bactérias OP50. Cresça uma população branqueada em bactérias OP50 a 15 °C até chegar ao estágio L4 (aproximadamente 4 dias). As larvas L4 podem ser reconhecidas por um patch branco aproximadamente no meio do lado ventral do verme usando um estereótipo padrão.
      NOTA: Para alcançar a célula germinaída ao fenótipo de conversão de neurônios após o esgotamento do lin-53,ele precisa ser esgotado na geração parental (P0). A pontuação para o fenótipo de conversão é realizada na geração seguinte (geração filial F1). Para alcançar o esgotado lin-53 já no P0, os animais L4 são submetidos à RNAi.
6. Transfira manualmente 50 worms de estágio L4 por réplica usando um fio de platina para uma placa NGM que não contenha nenhuma bactéria e deixe os vermes se afastarem de qualquer bactéria OP50 transferida. Deixe os vermes se moverem na placa por cerca de 5 minutos. Use bactérias das placas NGM-Agar RNAi previamente semeadas com bactérias lin-53 RNAi (ou controle de vetor vazio) para transferir para as respectivas placas RNAi.
   1. Evite transferir bactérias OP50 para as placas RNAi reais. Trabalhe rápido para minimizar o tempo de exposição da cepa a temperaturas superiores a 15 °C.
7. Incubar vermes nas placas NGM-Agar RNAi a 15 °C por aproximadamente 7 dias até que a prole F1 dos vermes atinja o estágio L3 – L4. Eles podem ser claramente separados dos animais P0, uma vez que eles são maiores e mais grossos do que a prole F1.
   1. Verifique visualmente sob um estereótipo padrão se os vermes progêneros F1 mostram o fenótipo de vulva saliente(pvul),como mostrado na Figura 1. RNAi contra lin-53 tem efeitos pleiotrópicos e causa o fenótipo pvul que pode ser usado para avaliar se rnAi contra lin-53 foi bem sucedido.
      NOTA:  RNAi contra lin-53 também pode causar letalidade de embriões F1. Este efeito aumenta se as placas forem expostas a graus superiores a 15 °C antes que os animais cheguem ao estágio L3 – L4. Embriões mortos podem ser reconhecidos pelo desenvolvimento preso e falta de eclosão.
   2. Incubar placas no escuro, já que o IPTG é sensível à luz.

Representative Results

Figura 1: Fenótipo Pvul causado pela RNAi contra lin-53. (Topo) Imagem dic de L4/jovens adultos estágio F1 progêneros derivados do controle ou lin-53 RNAi mães tratadas. Barras de escala = 20 μm. (Inferior) Animais tratados com lin-53 RNAi exibem o fenótipo de vulva saliente(pvul) (cabeças de flecha preta). O fenótipo pvul confirma que rnai contra lin-53 foi bem sucedido. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654