RNAi Chapado para alimentación C. elegans: Una técnica para inducir la expresión de dsRNA objetivo en E. coli

Overview

Este video describe los principios detrás del tratamiento con RNAi en C. elegans y demuestra un protocolo para derribar lin-35 en una cepa de gusano transgénico.

Protocol

Este protocolo se extrae de Kolundzic, et al, Aplicación de RNAi y expresión de factor de transcripción inducida por choque de calor para reprogramar células germinales a neuronas en C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparación de soluciones
   1. Placas NGM-Agar (1 L)
      1. Añadir 3 g de NaCl, 2,5 g de medios de peptona (por ejemplo, Bacto-Peptone), y 20 g de agar. Después del autoclave, añadir 1 ml de colesterol (5 mg/ml en 95% de stock etoh), 1 ml de 1 M MgSO_4,1 ml de 1 M CaCl2, 25 ml de 1 M K2PO_4,y 1 ml de anfotericina B (2,5 mg/mL de stock).
   2. Placas NGM-Agar RNAi (1 L)
      1. Añadir 3 g de NaCl, 2,5 g de medios de peptona y 20 g de agar. Después de autoclavar añadir, 1 ml de colesterol (5 mg/ml en 95% stock de EtOH), 1 ml de 1 M MgSO_4,1 ml de 1 M CaCl2, 25 ml de 1 M K₂PO_4,1 ml de anfotericina B (2,5 mg/mL de caldo), 1 ml de 1 M IPTG y 1 ml de carbenicilina (50 mg/ml).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Añadir 10 g de medios de peptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 20 g de agar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Agregue H₂O a 1 L. Después del autoclave, añadir 1 ml de 50 mg/ml de carbenicilina y 2,5 ml de 5 mg/ml de tetraciclina.
   4. Medio LB (1 L)
      1. Añadir 10 g de medios de peptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, y 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Agregue H₂O a 1 L. Después del autoclave, añadir 1 ml de 50 mg/ml de carbenicilina.
   5. Amortiguador M9 (1 L)
      1. Añadir 6,0 g de Na₂HPO_4,3 g de KH₂PO_4,5 g de NaCl, y 50 mg de gelatina. Antes de su uso, añadir 1 ml de 1 M MgSO₄.
   6. Solución de blanqueo (10 ml)
      1. Añadir 1 mL de NaClO y 2 ml de 5 N NaOH. Agregue H2O a 10 mL.
2. Preparación de placas RNAi
   NOTA: C. elegans se cultiva típicamente en el laboratorio en placas Petri de 6 cm que contienen 7,5 ml de agar medio de crecimiento de nematodos (NGM-Agar). Este protocolo está optimizado para gusanos mantenidos a 15 °C. Para preparar placas con NGM, utilice técnicas estériles estándar para prevenir la contaminación fúngica y bacteriana. El siguiente es el protocolo para preparar placas NGM complementadas con reactivos para RNAi.
   1. Prepare placas NGM-Agar RNAi de 6 cm que contengan 1 mM de isopropilo β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) y 50 μg/ml de carbenicilina. Déjelos secar durante 24 – 48 h a temperatura ambiente en la oscuridad^12.
      1. Mantenga las placas RNAi a 4 °C en la oscuridad. No usar si tiene más de 14 días.
   2. Seleccione el clon de la bacteria RNAi(Escherichia coli HT115)que contiene el plásmido L4440 con la secuencia de ADN del gen lin-53 del caldo de glicerol congelado de la biblioteca RNAi disponible en placas lb-agar que contienen 50 μg/ml de carbenicilina y 12,5 μg/ml de tetraciclina mediante el uso del patrón de rayado trifásico. Cultivar la bacteria a 37 °C durante la noche. Este clon permite la producción dependiente de IPTG de lin-53 dsRNA en la bacteria.
      1. Además, cultivar bacterias RNAi que contienen el plásmido L4440 sin ninguna secuencia genética como el control de vectores vacíos.
   3. Al día siguiente, elija una sola colonia de lin-53 o placas de agar LB vector vacías utilizando una punta de pipeta de 200 μL e inocular cada una de ellas en un tubo de cultivo separado que contenga 2 ml de medio líquido LB complementado con 50 μg/ml de carbenicilina. Cultivar cultivos durante la noche a 37 °C hasta que alcancen una densidad óptica (OD) a 600 nm de 0,6 – 0,8. Mida el OD utilizando un espectrofotómetro.
      PRECAUCIÓN: El medio lb líquido no debe contener tetraciclina en contraste con la placa LB-agar utilizada para rayar las bacterias de la población de glicerol, ya que la inclusión de la tetraciclina durante la alimentación conduce a una disminución de la eficiencia del RNAi.
   4. Añadir 500 μL de cada cultivo bacteriano(lin-53 o vector vacío) a 6 cm NGM-Agar placas RNAi utilizando un multipipette. Incubar platos con una tapa cerrada durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad para secar. Durante este tiempo, el IPTG en las placas NGM inducirá la producción de dsRNA en la bacteria.
      1. Utilice al menos 3 placas por cultivo bacteriano por experimento. Esto proporcionará 3 réplicas técnicas para cada experimento.
   • Almacene las placas secas NGM-agar RNAi con bacterias a 4 °C en la oscuridad durante un tiempo de hasta dos semanas.
3. Preparación de C. elegans Strain BAT28
4. Mantener la cepa de gusano BAT28 que contiene los transgéneos otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] y ntIs1 [gcy-5prom::gfp] en las bacterias OP50 utilizando placas estándar NGM-Agar a 15 °C.
   NOTA: Para un protocolo detallado sobre la cultura nematoda, véase. El rol-6(su1006) es un alelo dominante y comúnmente utilizado marcador de inyección fenotípica¹⁶ que causa el movimiento de rodadura típico. Se utiliza en el transgénero otIs305 para rastrear hsp-16.2prom::che-1.
   1. Mantenga la cepa BAT28 a 15 °C en todo momento para evitar la activación precautoria del transgénero hsp-16.2prom::che-1. Reduzca la exposición a temperaturas superiores a 15 °C mientras manipula la tensión tanto como sea posible.
5. Para sincronizar la edad de los gusanos, utilice la técnica de blanqueamiento.
   1. Lave las placas NGM-Agar de 6 cm que contengan adultos y huevos de BAT28 utilizando 900 μL M9 buffer. Gusanos de pellets centrifugando a 900 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante.
   2. Añadir 0,5 – 1 ml de solución de blanqueo y agitar el tubo durante aproximadamente 1 minuto hasta que los gusanos adultos comiencen a abrirse. Monitoree con un estereomicroscopio estándar.
   3. Gusanos de pellets centrifugando a 900 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante.
   4. Lave el pellet de gusano 3 veces añadiendo 800 μL de amortiguador M9 y centrifugando a 900 x g.
   5. Coloque los huevos limpios en placas NGM frescas con bacterias OP50. Cultivar una población blanqueada en bacterias OP50 a 15 °C hasta que lleguen a la etapa L4 (aproximadamente 4 días). Las larvas L4 pueden ser reconocidas por un parche blanco aproximadamente a la mitad a lo largo del lado ventral del gusano usando un estereomicroscopio estándar.
      NOTA: Para lograr el fenotipo de conversión de células germinales a neuronas tras el agotamiento de lin-53,debe agotarse en la generación parental (P0). La puntuación para el fenotipo de conversión se lleva a cabo en la siguiente generación (generación filial F1). Para lograr el agotamiento lin-53 ya en el P0, los animales L4 son sometidos a RNAi.
6. Transfiera manualmente gusanos de etapa 50 L4 por réplica utilizando un cable de platino a una placa NGM que no contenga ninguna bacteria y deje que los gusanos se alejen de cualquier bacteria OP50 transferida. Deje que los gusanos se muevan en el plato durante unos 5 minutos. Utilice bacterias de las placas NGM-Agar RNAi previamente sembradas con bacterias LIN-53 RNAi (o control de vectores vacíos) para transferirlas a las placas RNAi respectivas.
   1. Evite transferir bacterias OP50 a las placas reales de RNAi. Trabaje rápido para minimizar el tiempo de exposición de la cepa a temperaturas superiores a 15 °C.
7. Incubar gusanos en placas NGM-Agar RNAi a 15 °C durante aproximadamente 7 días hasta que la progenie F1 de los gusanos alcance la etapa L3 – L4. Se pueden separar claramente de los animales P0 ya que son más grandes y gruesos que la progenie F1.
   1. Compruebe visualmente bajo un estereomicroscopio estándar si los gusanos de progenie F1 muestran el fenotipo vulva saliente (pvul) como se muestra en la Figura 1. RNAi contra lin-53 tiene efectos pleiotrópicos y causa el fenotipo pvul que se puede utilizar para evaluar si RNAi contra lin-53 ha sido exitoso.
      NOTA:  Los ISR contra lin-53 también pueden causar letalidad de embriones de F1. Este efecto aumenta si las placas están expuestas a grados superiores a 15 °C antes de que los animales lleguen a la etapa L3 – L4. Los embriones muertos pueden ser reconocidos por el desarrollo arrestado y la falta de eclosión.
   2. Incubar placas en la oscuridad ya que IPTG es sensible a la luz.

Representative Results

Figura 1: Fenotipo de Pvul causado por arlín contra lin-53. (Arriba) Imagen DIC de gusanos progenie en etapa F1 L4/adultos jóvenes derivados del control o madres tratadas con RNAi lin-53. Barras de escala = 20 μm. (Inferior) Los animales tratados con lin-53 RNAi muestran el fenotipo vulva saliente(pvul)(puntas de flecha negras). El fenotipo pvul confirma que el RNAi contra lin-53 tuvo éxito. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654