Placcatura RNAi per alimentazione C. elegans: una tecnica per indurre l'espressione di dsRNA bersaglio in E. coli

Overview

Questo video descrive i principi alla base del trattamento RNAi in C. elegans e dimostra un protocollo per abbattere il lin-35 in un ceppo di vermi transgenici.

Protocol

Questo protocollo è tratto da Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparazione della soluzione
   1. Piastre NGM-Agar (1 L)
      1. Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone media (ad esempio Bacto-Peptone) e 20 g di agar. Dopo l'autoclave, aggiungere 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in stock EtOH al 95%, 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di 1 M CaCl2, 25 mL di 1 M K2PO₄e 1 mL di ampotericina B (2,5 mg/mL stock).
   2. Targhe NGM-Agar RNAi (1 L)
      1. Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone e 20 g di agar. Dopo l'aggiunta di autoclave, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in stock EtOH al 95%, 1 mL di 1 M MgSO_{4, 1}mL di 1 M CaCl2, 25 mL di 1 M K₂PO₄, 1 mL di ampotericina B (2,5 mg/mL), 1 mL di 1 M IPTG e 1 mL di carbenicillina (50 mg/mL).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Aggiungere 10 g di peptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl, 20 g di agar, 10 mL di 1 M Tris pH 8.0. Aggiungere H₂O a 1 L. Dopo l'autoclave, aggiungere 1 mL di 50 mg/mL di carbenicillina e 2,5 mL di 5 mg/mL di tetraciclina.
   4. Mezzo LB (1 L)
      1. Aggiungere 10 g di peptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl e 10 mL di 1 M Tris pH 8.0. Aggiungere H₂O a 1 L. Dopo l'autoclave, aggiungere 1 mL di 50 mg/mL di carbenicillina.
   5. M9-buffer (1 L)
      1. Aggiungere 6,0 g di Na₂HPO₄, 3 g di KH₂PO_4,5 g di NaCl e 50 mg di gelatina. Prima dell'uso, aggiungere 1 mL di 1 M MgSO₄.
   6. Soluzione di sbiancamento (10 mL)
      1. Aggiungere 1 mL di NaClO e 2 mL di 5 N NaOH. Aggiungere H2O a 10 mL.
2. Preparazione delle piastre RNAi
   NOTA: C. elegans è tipicamente coltivato in laboratorio su piastre di Petri da 6 cm contenenti 7,5 mL di Agar medio di crescita nematode (NGM-Agar). Questo protocollo è ottimizzato per i worm mantenuti a 15 °C. Per preparare piastre con NGM, utilizzare tecniche sterili standard per prevenire la contaminazione fungina e batterica. Di seguito è riportato il protocollo per la preparazione di piastre NGM integrate con reagenti per RNAi.
   1. Preparare piastre NGM-Agar RNAi da 6 cm contenenti 1 mM di isopropil β-D-1-tiogalactopiranoside (IPTG) e 50 μg/mL di carbenicillina. Lasciarli asciugare per 24 - 48 ore a temperatura ambiente al buio¹².
      1. Tenere le piastre RNAi a 4 °C al buio. Non utilizzare se più vecchio di 14 giorni.
   2. Selezionare il clone dei batteri RNAi (Escherichia coli HT115) contenente il plasmide L4440 con la sequenza di DNA genico lin-53 dal materiale glicerolo congelato dalla libreria RNAi disponibile sulle piastre LB-agar contenenti 50 μg/mL di carbenicillina e tetraciclina da 12,5 μg/mL utilizzando il modello di striatura trifase. Far crescere i batteri a 37 °C durante la notte. Questo clone consente la produzione dipendente da IPTG di lin-53 dsRNA nei batteri.
      1. Inoltre, far crescere i batteri RNAi che contengono il plasmide L4440 senza alcuna sequenza genica come controllo vettoriale vuoto.
   3. Il giorno successivo, scegli una singola colonia da piastre LB-agar vettoriali lin-53 o vuote utilizzando una punta di pipetta da 200 μL e inocula ciascuna di esse in un tubo di coltura separato contenente 2 ml di mezzo liquido LB integrato con carbenicillina da 50 μg/ml. Coltiva le colture durante la notte a 37 °C fino a raggiungere una densità ottica (OD) a 600 nm di 0,6 - 0,8. Misurare l'OD utilizzando uno spettrofotometro.
      ATTENZIONE: Il supporto liquido LB non deve contenere tetraciclina in contrasto con la piastra LB-agar utilizzata per striare i batteri dallo stock di glicerolo, poiché l'inclusione della tetraciclina durante l'alimentazione porta a una diminuzione dell'efficienza RNAi.
   4. Aggiungere 500 μL di ogni coltura batterica(lin-53 o vettore vuoto) a piastre NGM-Agar RNAi da 6 cm utilizzando una multipipetta. Incubare le piastre con un coperchio chiuso durante la notte a temperatura ambiente al buio per asciugare. Durante questo periodo, l'IPTG nelle piastre NGM indurrà la produzione di dsRNA nei batteri.
      1. Utilizzare almeno 3 piastre per coltura batterica per esperimento. Ciò fornirà 3 repliche tecniche per ogni esperimento.
   • Conservare le piastre NGM-agar RNAi essiccate con batteri a 4 °C al buio per un massimo di due settimane.
3. Preparazione del ceppo C. elegans BAT28
4. Mantenere il ceppo worm BAT28 contenente i transgeni otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] e ntIs1 [gcy-5prom::gfp] sui batteri OP50 utilizzando piastre NGM-Agar standard a 15 °C.
   NOTA: Per un protocollo dettagliato sulla cultura dei nematodi, vedi. Il rol-6(su1006) è un allele dominante e marcatore di iniezione fenotipico^{comunemente usato 16} che causa il tipico movimento di laminazione. Viene utilizzato nella transgene otIs305 per tenere traccia di hsp-16.2prom::che-1.
   1. Mantenere il ceppo BAT28 a 15 °C in ogni momento per evitare l'attivazione precauzionale del transgene hsp-16.2prom::che-1. Ridurre l'esposizione a temperature superiori a 15 °C durante la manipolazione del ceppo il più possibile.
5. Per sincronizzare i vermi con l'età, utilizzare la tecnica di sbiancamento.
   1. Lavare via piastre NGM-Agar da 6 cm contenenti adulti e uova di BAT28 utilizzando tampone M9 da 900 μL. Vermi pellet centrifugando a 900 x g per 1 min. Rimuovere il supernatante.
   2. Aggiungere 0,5 - 1 ml di soluzione di sbiancamento e agitare il tubo per circa 1 minuto fino a quando i vermi adulti iniziano a scoppiare. Monitor utilizzando uno stereomicroscopio standard.
   3. Vermi pellet centrifugando a 900 x g per 1 min. Rimuovere il supernatante.
   4. Lavare il pellet di verme 3 volte aggiungendo 800 μL di tampone M9 e centrifugando a 900 x g.
   5. Posizionare le uova pulite su piatti NGM freschi seminati con batteri OP50. Far crescere una popolazione sbiancata sui batteri OP50 a 15 °C fino a raggiungere lo stadio L4 (circa 4 giorni). Le larve L4 possono essere riconosciute da una macchia bianca approssimativamente a metà strada lungo il lato ventrale del verme usando uno stereomicroscopio standard.
      NOTA: Per ottenere il fenotipo di conversione da cellula germinale a neurone dopo l'esaurimento del lin-53, deve essere impoverito nella generazione dei genitori (P0). Il punteggio per il fenotipo di conversione viene effettuato nella generazione successiva (generazione filiale F1). Per ottenere l'esaurito lin-53 già nel P0, gli animali L4 sono sottoposti a RNAi.
6. Trasferire manualmente 50 vermi stadio L4 per replicare utilizzando un filo di platino su una piastra NGM che non contiene batteri e lasciare che i vermi si allontanino da qualsiasi batterio OP50 trasferito. Lascia che i vermi si muovano sul piatto per circa 5 minuti. Utilizzare batteri delle piastre NGM-Agar RNAi precedentemente seminate con batteri lin-53 RNAi (o controllo vettoriale vuoto) per il trasferimento alle rispettive piastre RNAi.
   1. Evitare di trasferire batteri OP50 sulle piastre RNAi effettive. Lavorare velocemente per ridurre al minimo il tempo di esposizione della deformazione a temperature superiori a 15 °C.
7. Incubare i vermi sulle piastre NGM-Agar RNAi a 15 °C per circa 7 giorni fino a quando la progenie F1 dei vermi raggiunge lo stadio L3 - L4. Possono essere chiaramente separati dagli animali P0 poiché sono più grandi e spessi della progenie F1.
   1. Controllare visivamente sotto uno stereomicroscopio standard se i worm di progenie F1 mostrano il fenotipo vulva (pvul) sporgente, come illustrato nella figura 1. RNAi contro lin-53 ha effetti pleiotropici e provoca il fenotipo pvul che può essere utilizzato per valutare se RNAi contro lin-53 ha avuto successo.
      NOTA:  RNAi contro il lin-53 può anche causare letalità degli embrioni di F1. Questo effetto aumenta se le piastre sono esposte a gradi superiori a 15 °C prima che gli animali raggiungesse lo stadio L3 - L4. Gli embrioni morti possono essere riconosciuti dallo sviluppo arrestato e dalla mancanza di schiusa.
   2. Incubare le piastre al buio poiché IPTG è sensibile alla luce.

Representative Results

Figura 1: Fenotipo Pvul causato da RNAi contro lin-53. (In alto) Immagine DIC dei vermi di progenie F1 di stadio L4/giovani adulti derivati dal controllo o dalle madri trattate con lin-53 RNAi. Barre di scala = 20 μm. (in basso) Gli animali trattati con lin-53 RNAi mostrano il fenotipo vulva sporgente (pvul) (teste di freccia nere). Il fenotipo pvul conferma che RNAi contro lin-53 ha avuto successo. Barre di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654