RNAi Plating for C. elegans Feeding: En teknikk for å indusere mål dsRNA uttrykk i E. coli

Abstract

Kilde: Kolundzic, E., et al. Anvendelse av RNAi og heat-shock-indusert transkripsjon faktor uttrykk for å omprogrammere bakterieceller til nevroner i C. elegans. J. Vis. Utt. (2018).

Denne videoen beskriver prinsippene bak RNAi-behandling i C. elegans og demonstrerer en protokoll for å slå ned lin-35 i en transgen ormstamme.

Protocol

Denne protokollen er hentet fra Kolundzic, et al, Anvendelse av RNAi og Heat-shock-indusert transkripsjonsfaktoruttrykk for å omprogrammere bakterieceller til nevroner i C. elegans, J. Vis. Exp. (2018). Klargjøring av løsning NGM-Agar plater (1 L) Tilsett 3 g NaCl, 2,5 g peptonmedier (f.eks. bacto-peptone) og …

Representative Results

Figur 1: Pvul fenotype forårsaket av RNAi mot lin-53. (Øverst) DIC bilde av L4 / ung voksen scene F1 avkom ormer avledet fra kontroll eller lin-53 RNAi behandlet mødre. Skalastenger = 20 μm. (Bunn) Dyr behandlet med lin-53 RNAi viser den fremspringende vulva (pvul) fenotypen (svarte pilhoder). Pvul fenotypen bekrefter at RNAi mot lin-53 var vellykket. Skala…

Materials

Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
empty vetor: L4440	Addgene	#1654