Drosophila Optogenetica: een methode om neuronale circuits te manipuleren

Overview

Optogenetica maakt het gebruik van licht mogelijk om neuronen te manipuleren die genetisch zijn ontworpen om specifieke opsines-lichtgevoelige eiwitten uit te drukken waarvan de lichtactivatie een verandering in de toestand van het neuron teweegbrengt. Hier beschrijven we een optogenetische benadering in Drosophila met behulp van de opsin Channelrhodopsin2. Het voorbeeldprotocol bevat een optogenetische testset om het neuronale circuit achter het ontsnappingsgedrag van de vlieg te bestuderen.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit de Vries en Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).

1. Genereer Channelrhodopsin-vliegen

1. Cross UAS-ChR2 vliegt met de Gal4 driver van uw keuze, we gebruiken G105-Gal4, die wordt uitgedrukt in Foma-1 neuronen in de optische kwab.
2. Om de mogelijkheid van een visuele reactie op de blauwlichtstimulatie te elimineren, bevinden beide vlieglijnen zich op een w⁺norpA-achtergrond.
3. Eindresultaat: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Nadat volwassen vliegen eclose, zet geselecteerde vrouwtjes op vers voedsel, aangevuld met 10 μM all-trans-retinal (een co-factor vereist voor ChR2) en beschermd tegen licht, gedurende 3 dagen voor het uitvoeren van de gedragstest.

2. Maak 10 μM all-trans-retinale verbeterde voeding

1. Los 100 mg all-trans-retinal op in 17,6 ml 95% ethanol om 20 mM netvlies te maken. Houd all-trans-retinale te allen tijde beschermd tegen licht.
2. Smelt standaard maïsmeelvliegvoedsel in de magnetron en laat afkoelen tot het warm is om aan te raken.
3. Meng 50 μl 20 mM all-trans-retinal in flacons van 10 ml vliegvoer.
4. Laat de flacons afkoelen en bescherm ze tegen licht.

3. Uitrusting

1. Pipettips: Standaard 1.000 μl pipetpunten worden in de buurt van de punt gesneden, waardoor een poriediameter van ~ 2,25 mm ontstaat.
2. platform (zie figuur 1).
   1. Een Delrin-basis, 17 cm X 25 cm, werd gebouwd met schroefdraadgaten op elke hoek om 1/4" NPT koelvloeistofslangaansluitingen te passen.
   2. Een verticale houder, gemaakt van Delrin, is bevestigd aan het midden van de basis. De totale afmetingen zijn 25 mm X 40 mm X 65 mm (breedte X diepte X hoogte). Een 10 mm brede groef loopt over de lengte van de houder, met een duimschroef aan de onderkant. Aan de bovenkant van de houder is een platform bevestigd, 25 mm X 40 mm X 10 mm, met een gat met een diameter van 3,5 mm uitgelijnd met de groef in de houder.
3. LED-arrays (zie figuur 1).
   1. Vier armen van koelvloeistofslang, ~18 cm lang, worden met behulp van de koelvloeistofslangconnector op de platformbasis bevestigd. Koelvloeistofslang wordt alleen gebruikt als structurele ondersteuning en wordt niet gebruikt voor koeldoeleinden.
   2. Goed gespreide groeven worden in het laatste stuk koelmiddel van elke arm gesneden om een koellichaam aan het uiteinde van elke arm aan te brengen.
   3. Op elk koellichaam is een blauwe LED Rebel Tri-Stars gemonteerd met behulp van voorgesneden thermische plakband. Op elke Tri-Star wordt een Carclo 18° Tri-lens aangebracht.
   4. LED Tri-Stars zijn aangesloten op de BuckPuck DC drivers en een voeding zoals gespecificeerd. We hebben onze set-up geregeld met elke BuckPuck die twee Tri-Stars in serie aandrijft.
   5. Verlichting van alle vier LED Tri-Stars op 700 mA leverde een bestraling van 713 W/m² op ons platform op.
4. Camera: De camera is gemonteerd op een klein statief en gericht op de bovenkant van het platform.

4. Gedragstest

1. Verdoof vliegen kort op ijs.
2. Plaats individuele vliegen in pipetpunten, gebruik tape om beide uiteinden van de punt te sluiten.
3. Nadat de vliegen zijn ontwaakt en actief de pipetpunt verkennen, verwijdert u de tape en plaatst u een pipet in de groef in een verticale houder. De duimschroef wordt gebruikt om de pipettip op zijn plaats te houden en de onderkant van de punt te sluiten.
4. Terwijl de vlieg de pipettip verkent (meestal 30 - 60 sec), start u de camera-opname net voordat de vlieg uit de punt op het platform komt.
5. Nadat de vlieg op het platform is verschenen, wacht u 1-2 seconden en schakelt u de blauwe LED's in. Gebruik een timer om handmatig de tijd te meten totdat de vlieg de vlucht initieert.

Representative Results

Figuur 1: Experimentele opstelling met het platform met de verticale houder en de vier koelvloeistof hosing armen met koellichaamken met LED-arrays erop bevestigd. (A) De opstelling onder omgevingsverlichting. (B) De opstelling wanneer de LED's branden. (C) Een close-up van een Tri-Star LED op het koellichaam. (D) Een close-up van de Tri-Star met de tri-lens bevestigd. (E) Een schema van de Buckpuck Driver en LED circuit. (F) Schakelschema voor het BuckPuck- en LED-circuit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20