C. elegans Bewegingstracking: een methode om voortbeweging in wormen te beoordelen

Overview

Deze video beschrijft het gebruik van video- en trackingsoftware om wormbewegingen in een arena op te nemen.  Het voorbeeldprotocol meet het effect van blootstelling aan ethanol op de voortbeweging van wormen.

Protocol

Het volgende protocol is een uittreksel uit Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Stappen om uit te voeren op de dag voor de test

   1. Pluk L4-stadiumwormen op verse Nematodengroeimedium (NGM) platen gezaaid met een gazon van OP50 E. coli, en kweek ze bij 20 °C O/N. Elke testconditie vereist 10 wormen; kies een overmaat aan wormen om O/N-verlies van wormen mogelijk te maken.
      1. Test alleen dieren die eerstedagsvolwassenen zijn; veel mutanten groeien met een langzamere snelheid dan het wilde type. Pas de timing van het plukken aan voor stammen met ontwikkelingsachterstanden, zodat alle geteste dieren eerstedagsvolwassenen zijn.
2. Stappen om uit te voeren op de dag van de assay
   1. Voorbereiding op de test:
      1. Voer assays uit op standaard ongeplaatste 60 x 15 mm NGM platen. Droog alle te gebruiken platen bij 37 °C gedurende 2 uur, met deksels eraf. Gebruik voor elke experimentele proef vier gedroogde NGM-platen; dit zijn de ethanoltestplaten van 0 mM en 400 mM en de bijbehorende acclimatisatieplaten.
         OPMERKING: Het gebruik van NGM platen is hierbij belangrijk; verschillen in de samenstelling van de platen, met name hun osmolariteit, kunnen de dosisrespons van ethanol op gedrag sterk beïnvloeden, dit is ten minste gedeeltelijk te wijten aan veranderingen in de hoeveelheid ethanol die door de dieren wordt opgehoopt. NGM agar is 160 mOsm.
      2. Weeg na het drogen elk van de niet-geseed NGM-platen die bij de test moeten worden gebruikt en noteer het gewicht. Bepaal het volume van de media in de platen op basis van het gewicht van een lege plaat. Om de omzetting van het gewicht van de agar in volume te benaderen, gaat u ervan uit dat het medium hetzelfde weegt als een gelijk volume water.
         OPMERKING: Onze meest consistente resultaten zijn gevonden met NGM-media die voldoende zijn uitgedroogd dat een origineel volume van 10 ml een postdroogvolume heeft tussen 8,3-8,9 ml. Een alternatief voor de droogtijd van 2 uur is om te drogen totdat de platen dit volumebereik bereiken om rekening te houden met verschillen in incubators.
      3. Smelt 4 koperen ringen (binnendiameter van 1,6 cm) in het oppervlak van elk van de platen om te fungeren als kraaltjes voor de verschillende genotypen of behandelingsgroepen van wormen. Pak elke ring vast met een tang en verwarm in een vlam (een sterke vlam van een Bunsen-brander werkt goed) gedurende ongeveer 3 seconden. Plaats de ring onmiddellijk op een plaat terwijl u de ring met de tang vasthoudt om te voorkomen dat deze 'overslaat'.
         1. Zorg ervoor dat de ring plat tegen het oppervlak van de agar rust door op verschillende punten op de ring zachtjes met de tang naar beneden te drukken. Let er bij het plaatsen van de ring op dat er ruimte is voor nog eens drie ringen.
         2. Smelt de drie extra koperen ringen in het oppervlak van de plaat en zorg ervoor dat ze zo dicht mogelijk bij elkaar worden plaatsen, zodat ze alle vier in het gezichtsveld van de camera staan.
            OPMERKING: Het maken van een goede afdichting met de agar is essentieel om de wormen in de ringen te houden tijdens de test. Ringen die op de plaat overslaan, zullen waarschijnlijk niet de juiste afdichting met de agar maken en kunnen de agar littekens geven, waardoor wormen kunnen graven en de visualisatie van de wormen kunnen verstoren.
         3. Bereid voor elke testplaat een begeleidende "acclimatisatieplaat" voor, die moet worden gedroogd en ongezaad en geen ethanol ontvangt. Plaats vier koperen ringen op deze platen.
      4. Label de onderkant van de platen naast elke ring met de wormstam die in de ring moet worden gebruikt, zorg ervoor dat u niet in het gezichtsveld van de ring zelf schrijft. Match de etiketten op de testplaat met de bijbehorende acclimatisatieplaat.
      5. Bereken de hoeveelheid 100% ethanol die aan elke testplaat moet worden toegevoegd, zodat de uiteindelijke concentratie 0 mM of 400 mM ethanol (gewicht tot volume) is. Voor elk experiment (n = 1) is er één ethanolplaat van 0 mM en één ethanolplaat van 400 mM; acclimatisatieplaten ontvangen geen ethanol. Voeg de ethanol toe en spuit deze rond het oppervlak van de plaat. Gebruik laboratoriumfolie om de plaat af te dichten en laat deze 2 uur op de tafeltop equilibreren.
      6. Wanneer 1,5 uur is verstreken, begint u met de acclimatisatiestap van de test, stap 2.2.
   2. Voer voortbewegingstest uit: Assay-platen
      1. Breng voorzichtig 10 wormen van elke experimentele groep over naar het midden van een koperen ring op de acclimatisatieplaat. Verwijder alle voedsel dat op dit punt zichtbaar is op de agar door voorzichtig te schrapen met de wormpriem. Varieer de volgorde waarin de experimentele groepen op de platen worden geplaatst tijdens experimentele proeven, zodat dezelfde stammen niet in dezelfde volgorde op de platen worden geplaatst tijdens proeven.
         OPMERKING: Het doel is om de dieren met minimale hoeveelheden voedsel naar het bord over te brengen, want als voedsel op de acclimatisatieplaat naar de testplaat wordt overgebracht, zullen de wormen zich rond het voedsel verzamelen en zal het effect van het medicijn op de voortbeweging worden verduisterd.
      2. Wees voorzichtig om het oppervlak van de agar niet te breken met de plectrum, omdat dit de wormen in staat zal stellen zich te graven en de test zal verstoren. Incubeer de wormen bij RT gedurende 30 minuten.
      3. Zorg ervoor dat er een passend interval is tussen de initiaties van elke plaat. Een ervaren experimenteerder kan 40 dieren verplaatsen, 10/ring voor 4 ringen in < 1,5 min, maar elk interval tot 2 min is acceptabel. De standaardtest heeft films die opnemen op 10-12 minuten en 30-32 minuten blootstelling voor zowel 0 mM als 400 mM ethanol.
      4. Start de acclimatisatieplaat voor de 0 mM-belichting en de acclimatisatieplaat voor de 400 mM-belichting ongeveer 2 minuten en 30 seconden uit elkaar om het opslaan van het eerste filmbestand mogelijk te maken voordat de tweede film moet beginnen.
      5. Breng na de acclimatisatieperiode van 30 minuten de wormen over van de acclimatisatieplaten naar de testplaten. Breng de wormen over op de testplaten (0 mM of 400 mM ethanol) in dezelfde volgorde dat ze aan de acclimatisatieplaat zijn toegevoegd, en houd de timing tussen de voltooiingen van elke plaat bij. Sluit de plaat af met laboratoriumfolie om het verlies van ethanol aan verdamping te minimaliseren.
      6. Gebruik een schepbeweging met een dungerande afgeplatte wormpriem om wormen bovenop de afgeplatte plectrum te verzamelen. Voer de overdracht van wormen uit van de ongeziene acclimatisatieplaat naar de testplaat zonder het gebruik van bacteriën, die vaak wordt gebruikt bij het overbrengen van wormen omdat het helpt om de worm aan de pluk te lijmen.
         OPMERKING: De snelheid waarmee dieren bij deze stap worden overgedragen, is erg belangrijk omdat de eerste wormen op de plaat langer aan ethanol worden blootgesteld dan de laatste wormen die aan de plaat zijn toegevoegd, en eerdere tijdspunten kunnen enkele tijdsafhankelijke effecten vertonen. Dit is de belangrijkste reden om te roteren welke stammen als eerste op een plaat worden geplaatst bij experimentele replica's.
   3. Voer Locomotion Assay uit: filmen
      1. Gebruik een microscoop/cameracombinatie die gelijktijdige beeldvorming mogelijk maakt van alle vier de ringen in het gezichtsveld (ongeveer 42x42 mm² vierkant), zoals een 0,5x microscoop objectief, 0,8x vergroting en een camera met een 2048x2048 7,4 μm pixel CCD.
      2. Gebruik gelijkmatige verlichting in het gezichtsveld, wat helpt bij objectherkenning bij de intensiteitsdrempelstap. Een 3"x3" achtergrondverlichting werkt goed.
      3. Beeld de wormen op een plaat geplaatst media-side up (deksel naar beneden), die contrast genereert dat verloren gaat bij het gebruik van de achtergrondverlichting in vergelijking met een traditionele microscoop verzonden lichtbron.
      4. Bereid de beeldanalysesoftware voor om time-lapse-films van de bewegende wormen vast te leggen. Stel de software in om elke 1 seconde 12-bits grijswaardenafbeeldingen vast te leggen, als een film van 2 minuten (120 frames). Als u de grootte van het uitvoerbestand wilt verkleinen, terwijl u toch voldoende beeldresolutie behoudt, gebruikt u een binning-modus van 2x2 om afbeeldingen van 1024x1024 pixels vast te leggen.
      5. Neem de films op. Begin met het opnemen van een 120-frame film van de eerste plaat (0 mM ethanol) 10 minuten nadat de laatste wormen op die plaat waren geplaatst. Sla het filmbestand op.
      6. Neem de tweede plaat (400 mM ethanol) op. Herhaal dit proces voor beide platen vanaf 30 minuten nadat de laatste wormen op de eerste plaat (0 mM ethanol) zijn geplaatst om de tijdspunten van 30-32 minuten voor elke blootstelling vast te leggen.
         OPMERKING: Geef voldoende tijd om de afbeeldingsbestanden na elke opnamesessie op te slaan voordat u begint met het opnemen van de volgende plaat die moet worden geanalyseerd.
      7. Voor het toekomstbestendig maken van gearchiveerde films en om toe te staan dat deze films worden geopend en geanalyseerd door andere open source imaging-softwareprogramma's in het publieke domein, zoals ImageJ, converteert u een kopie van elke film naar 8-bits TIFF-bestanden met grijswaarden van 256.
         OPMERKING: De hier beschreven beeldanalysesoftware maakt gebruik van een eigen bestandsformaat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.