ג. אלגנס מעקב אחר תנועה: שיטה להערכת תנועה בתולעים

Overview

סרטון וידאו זה מתאר את השימוש בתוכנות וידאו ומעקב כדי לתעד תנועת תולעים בזירה.  פרוטוקול הדוגמה מודד את ההשפעה של חשיפה לאתנול על תנועה תולעת.

Protocol

הפרוטוקול הבא הוא קטע מ Davies et al, אסאי למדידת ההשפעות של אתנול על מהירות תנועה של אלגנים Caenorhabditis, J. Vis. Exp. (2015).

1. שלבים לביצוע ביום שלפני ההסתעפות

   1. בחר תולעי שלב L4 ללוחות בינוניים של צמיחה נמטודית טרייה (NGM) עם מדשאה של OP50 E. coli, ותרבות אותם ב 20 °C O/N. כל תנאי מבחנים דורש 10 תולעים; בחר עודף של תולעים כדי לאפשר O / N אובדן של תולעים.
      1. רק בעלי חיים מבחנים שהם מבוגרים של היום הראשון; מוטנטים רבים גדלים במהירות איטית יותר מסוג פראי. התאם את עיתוי הקטיף לזנים בעלי עיכובים התפתחותיים כך שכל בעלי החיים שנבדקו הם מבוגרים של היום הראשון.
2. צעדים לביצוע ביום ההסתעפות
   1. הכנה לבדיקה:
      1. בצע בדיקות על לוחות NGM סטנדרטיים ללא תפוקה של 60 x 15 מ"מ. יבש את כל הצלחות לשימוש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות, עם מכסים כבויים. עבור כל ניסוי ניסיוני, השתמש בארבעה לוחות NGM מיובשים; אלה יהיו 0 mM ו 400 mM אתנול assay צלחות ואתלחות התאקלמות הנלוות שלהם.
         שים לב: השימוש בלוחות NGM חשוב כאן; הבדלים בהרכב של הצלחות, במיוחד osmolarity שלהם, יכול להשפיע מאוד על תגובת המינון של אתנול על התנהגות, זה נובע, לפחות בחלקו, לשינויים בכמות האתנול שנצבר על ידי בעלי החיים. אגר NGM הוא 160 mOsm.
      2. לאחר הייבוש, שוקלים כל אחת מלוחות ה-NGM שלא נאכלו לשימוש במהלך ההסתעפות ומציין את המשקל. קבע את נפח המדיה בלוחות בהתבסס על משקל לוח ריק. כדי להעריך את ההמרה של משקל האגר לנפח, להניח כי התקשורת שוקלת זהה נפח שווה של מים.
         שים לב: התוצאות העקביות ביותר שלנו נמצאו עם מדיה NGM כי התייבש מספיק כי נפח מקורי 10 מיליליטר יש נפח לאחר ייבוש בין 8.3-8.9 מ"ל. חלופה לזמן היבש של שעתיים היא להתייבש עד שהצלחות יגיעו לטווח נפח זה כדי להסביר את ההבדלים באינקובטורים.
      3. להמיס 4 טבעות נחושת (קוטר פנימי של 1.6 ס"מ) לתוך פני השטח של כל אחד הלוחות לשמש כלאוצרות עבור גנוטיפים שונים או קבוצות טיפול של תולעים. אוחזים בכל טבעת במלקחיים, ומחממים בלהבה (להבה חזקה ממבער בונזן עובדת היטב) במשך כ-3 שניות. מיד למקם את הטבעת על צלחת תוך החזקת הטבעת עם מלקחיים כדי למנוע ממנו "דילוג".
         1. ודא כי הטבעת נשענת שטוח על פני השטח של אגר על ידי לחיצה בעדינות עם מלקחיים בכמה נקודות על הטבעת. בעת הנחת הטבעת, הקפידו להשאיר מקום לשלוש טבעות נוספות.
         2. ממיסים את שלוש טבעות הנחושת הנוספות אל פני השטח של הצלחת, תוך דאגה למקם אותן קרוב ככל האפשר זה לזה, כך שכל הארבעה יהיו בשדה הראייה של המצלמה.
            שים לב: ביצוע חותם טוב עם אגר חיוני כדי לשמור על התולעים בטבעות במהלך ההסתערות. טבעות לדלג על הצלחת סביר לעשות את החותם הנכון עם אגר ועלול צלקת אגר, אשר מאפשר תולעים להתחפר ומפריע לדמיין את התולעים.
         3. עבור כל צלחת מבחנים להכין צלחת "התאקלמות" נלווית, אשר צריך להיות מיובש ו unseed ולא יקבל אתנול. מניחים ארבע טבעות נחושת על הצלחות האלה.
      4. תווית החלק התחתון של הצלחות ליד כל טבעת עם זן התולעת לשמש בזירה, מקפיד לא לכתוב בשדה הראייה של הטבעת עצמה. להתאים את התוויות על צלחת ההסמכה עם צלחת התאקלמות הנלווית שלה.
      5. לחשב את הסכום של 100% אתנול להוסיף לכל צלחת assay כך הריכוז הסופי הוא 0 mM או 400 mM אתנול (משקל לנפח). עבור כל ניסוי(n = 1), יהיה אחד 0 mM ו צלחת אתנול 400 מ"מ; צלחות התאקלמות אינן מקבלות אתנול. מוסיפים את האתנול, צנרת אותו סביב פני השטח של הצלחת. השתמש בסרט מעבדה כדי לאטום את הצלחת ולאפשר לו לשוויון על הספסל העליון במשך 2 שעות.
      6. כאשר 1.5 שעות חלף, להתחיל את שלב התאקלמות של ההסתערות, שלב 2.2.
   2. בצעו מבחני תנועה: צלחות אסאי
      1. בזהירות להעביר 10 תולעים של כל קבוצת ניסוי למרכז טבעת נחושת על צלחת התאקלמות. הסר כל מזון שנראה על האגר בשלב זה על ידי גירוד בעדינות עם בחר התולעת. לשנות את הסדר שבו קבוצות הניסוי לשים על הצלחות על פני ניסויים ניסיוניים, כך אותם זנים אינם לשים על הצלחות באותו סדר על פני ניסויים.
         שים לב: המטרה היא להעביר את בעלי החיים לצלחת עם כמויות מינימליות של מזון, כי אם מזון על צלחת התאקלמות מועבר לצלחת assay התולעים יצברו סביב המזון ואת ההשפעה של התרופה על תנועה יהיה מוסתר.
      2. היזהר לא לשבור את פני השטח של אגר עם לבחור, כמו זה יאפשר את התולעים למחילה יהיה לשבש את ההסתערות. דגירה את התולעים ב RT במשך 30 דקות.
      3. ודא שיש מרווח מתאים בין החניכה של כל צלחת. ניסוי מנוסה יכול להזיז 40 בעלי חיים, 10/טבעת במשך 4 טבעות ב - 1.5 דקות, אך כל מרווח של עד 2 דקות מקובל. לבדיקה הסטנדרטית יש הקלטת סרטים ב 10-12 דקות ו 30-32 דקות של חשיפה הן 0 mM ו 400 mM אתנול.
      4. ליזום את צלחת התאקלמות לחשיפה 0 מ"מ ואת צלחת התאקלמות לחשיפה 400 מ"מ כ 2 דקות ו 30 שניות זה מזה כדי לאפשר שמירה של קובץ הסרט הראשון לפני הסרט השני חייב להתחיל.
      5. לאחר תקופת התאקלמות של 30 דקות, מעבירים את התולעים מלוחות התאקלמות ללוחות ההסתגלות. מעבירים את התולעים ללוחות ההסתגלות (0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול) באותו סדר שבו נוספו ללוח התאקלמות, תוך מעקב אחר התזמון בין ההשלמות של כל צלחת. לאטום את הצלחת עם סרט מעבדה כדי למזער את אובדן אתנול לאידוי.
      6. השתמשו בתנועת כף מדידה בעזרת בחירת תולעת שטוחה בעלת קצוות דקים לאיסוף תולעים מעל הפיק השטוח. בצע את העברת התולעים מלוח התאקלמות unseeded לצלחת התסמכות ללא שימוש בחיידקים, אשר משמש בדרך כלל בהעברת תולעים כפי שהוא עוזר להדביק את התולעת לפיק.
         שים לב: המהירות שבה בעלי חיים מועברים בשלב זה חשובה מאוד מכיוון שהתולעים הראשונות על הצלחת ייחשפו לאתנול זמן רב יותר מהתולעים האחרונות שנוספו לצלחת, ונקודות זמן מוקדמות יותר עשויות להראות השפעות תלויות זמן. זוהי הסיבה העיקרית לסיבוב אילו זנים ממוקמים על צלחת תחילה על פני משכפלים ניסיוניים.
   3. לבצע תנועה Assay: צילום
      1. השתמש בשילוב מיקרוסקופ/מצלמה המאפשר הדמיה בו זמנית של כל ארבע הטבעות בשדה הראייה (כ- 42x42 מ"מ² ריבוע), כגון מטרת מיקרוסקופ 0.5x, הגדלה של 0.8x ומצלמה עם CCD פיקסל 2048x2048 7.4 מיקרומטר.
      2. השתמש בתאורה אחידה לאורך שדה הראייה, המסייע בזיהוי אובייקטים בשלב סף העוצמה. תאורה אחורית בגודל 3"x3" פועלת היטב.
      3. צלם את התולעים על לוח הממוקם בצד המדיה כלפי מעלה (מכסה כלפי מטה), מה שיוצר ניגודיות שאבדה בעת שימוש באור האחורי בהשוואה למקור אור מסורתי המועבר במיקרוסקופ.
      4. הכן את תוכנת ניתוח התמונה כדי ללכוד סרטים לשגות בזמן של התולעים הנעות. הגדר את התוכנה ללכידת תמונות בקנה מידה אפור של 12 סיביות כל 1 שניות, כסרט של 2 דקות (120 פריימים). כדי להקטין את קובץ הפלט, תוך שמירה על רזולוציית תמונה מספקת, השתמש במצב איתור 2x2 כדי ללכוד תמונות פיקסלים של 1024x1024.
      5. תקליט את הסרטים. התחל להקליט סרט בן 120 פריימים של הצלחת הראשונה (0 מ"מ אתנול) 10 דקות לאחר שהתולעים האחרונות הונחו על הצלחת. שמור את קובץ הסרט.
      6. להקליט את הצלחת השנייה (400 mM אתנול). חזור על תהליך זה עבור שתי הצלחות החל מ 30 דקות לאחר התולעים האחרונות הונחו על הצלחת הראשונה (0 mM אתנול) כדי ללכוד את 30-32 דקות נקודות זמן עבור כל חשיפה.
         שים לב: אפשר די זמן לשמירת קבצי התמונה לאחר כל הפעלת לכידה לפני תחילת ההקלטה של הלוח הבא שיש לנתח.
      7. להגהה עתידית של סרטים המאוחסנים בארכיון ולאפשר פתיחה וניתוח של סרטים אלה על-ידי תוכנות אחרות להדמיית קוד פתוח של תחום ציבורי, כגון ImageJ, המר עותק של כל סרט לקבצי TIFF בקנה מידה אפור של 8 סיביות.
         שים לב: תוכנת ניתוח התמונה המתוארת כאן משתמשת בתבנית קובץ קניינית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.