C. elegans Seguimiento del movimiento: un método para evaluar la locomoción en gusanos

Overview

Este video describe el uso de software de video y seguimiento para grabar el movimiento de gusanos en una arena.  El protocolo de ejemplo mide el efecto de la exposición al etanol en la locomoción del gusano.

Protocol

El siguiente protocolo es un extracto de Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. (2015).

1. Pasos a realizar el día antes del ensayo

   1. Elija gusanos de etapa L4 en placas frescas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con un césped de OP50 E. coli,y cultéelos a 20 °C O/N. Cada condición de ensayo requiere 10 gusanos; recoger un exceso de gusanos para permitir la pérdida de gusanos O /N.
      1. Sólo asestrea animales que son adultos primer día; muchos mutantes crecen a una velocidad más lenta que el tipo salvaje. Ajuste el tiempo de recolección de cepas que tengan retrasos en el desarrollo para que todos los animales probados sean adultos primer día.
2. Pasos a realizar el día del ensayo
   1. Preparación para el ensayo:
      1. Realice ensayos en placas NGM estándar sin semilla de 60 x 15 mm. Seque todas las placas que se utilizarán a 37 °C durante 2 horas, con tapas apagadas. Para cada ensayo experimental, utilice cuatro placas NGM secas; estas serán las placas de ensayo de etanol de 0 mM y 400 mM y sus placas de aclimatación que lo acompañan.
         NOTA: El uso de placas NGM es importante aquí; diferencias en la composición de las placas, en particular su osmolaridad, puede afectar fuertemente la respuesta de la dosis de etanol en el comportamiento, esto se debe, al menos en parte, a cambios en la cantidad de etanol acumulado por los animales. El agar NGM mide 160 mOsm.
      2. Después del secado, pesar cada una de las placas NGM sin semilla que se utilizarán en el ensayo y tenga en cuenta el peso. Determine el volumen de medios en las placas en función del peso de una placa vacía. Para aproximar la conversión de peso del agar al volumen, supongamos que el medio pesa lo mismo que un volumen igual de agua.
         NOTA: Nuestros resultados más consistentes se han encontrado con medios NGM que se han deshidratado lo suficiente como para que un volumen original de 10 ml tenga un volumen posterior al secado entre 8,3 y 8,9 ml. Una alternativa al tiempo seco de 2 horas es secarse hasta que las placas alcancen este rango de volumen para tener en cuenta las diferencias en las incubadoras.
      3. Derretir 4 anillos de cobre (diámetro interno de 1,6 cm) en la superficie de cada una de las placas para actuar como corrales para los diferentes genotipos o grupos de tratamiento de gusanos. Sujete cada anillo con fórceps y caliente en una llama (una llama fuerte de un quemador Bunsen funciona bien) durante aproximadamente 3 s. Coloque inmediatamente el anillo en una placa mientras todavía sostiene el anillo con los fórceps para evitar que se 'salte'.
         1. Asegúrese de que el anillo descansa plano contra la superficie del agar presionando suavemente con los fórceps en varios puntos del anillo. Al colocar el anillo, tenga cuidado de dejar espacio para otros tres anillos.
         2. Derretir los tres anillos de cobre adicionales en la superficie de la placa, teniendo cuidado de colocarlos lo más cerca posible para que los cuatro estén en el campo de visión de la cámara.
            NOTA: Hacer un buen sello con el agar es esencial para mantener los gusanos en los anillos durante el ensayo. Es poco probable que los anillos que saltan en la placa hagan el sello correcto con el agar y puedan asustar al agar, lo que permite a los gusanos cavar e interfiere con la visualización de los gusanos.
         3. Para cada placa de ensayo preparar una placa de "aclimatación" que lo acompaña, que debe secarse y desprecintada y no recibirá etanol. Coloque cuatro anillos de cobre en estas placas.
      4. Etiquete la parte inferior de las placas junto a cada anillo con la cepa de gusano que se utilizará en el anillo, teniendo cuidado de no escribir en el campo de visión del anillo en sí. Haga coincidir las etiquetas de la placa de ensayo con su placa de aclimatación que lo acompaña.
      5. Calcular la cantidad de etanol 100% para añadir a cada placa de ensayo para que la concentración final sea de 0 mM o 400 mM de etanol (peso a volumen). Para cada experimento (n = 1), habrá una placa de etanol de 0 mM y una placa de etanol de 400 mM; placas de aclimatación no reciben etanol. Agregue el etanol, pipetting alrededor de la superficie de la placa. Utilice la película de laboratorio para sellar la placa y permitir que se equilible en la parte superior del banco durante 2 horas.
      6. Cuando haya transcurrido 1,5 horas, comience el paso de aclimatación del ensayo, paso 2.2.
   2. Realizar ensayos de locomoción: Placas de ensayo
      1. Transfiera cuidadosamente 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en la placa de aclimatación. Retire cualquier alimento que sea visible en el agar en este punto raspando suavemente con la selección de gusanos. Variar el orden en que los grupos experimentales se colocan en las placas a través de ensayos experimentales para que las mismas cepas no se pongan en las placas en el mismo orden a través de ensayos.
         NOTA: El objetivo es transferir a los animales al plato con cantidades mínimas de alimentos, ya que si los alimentos en el plato de aclimatación se transfieren a la placa de ensayo los gusanos se agregan alrededor de la comida y el efecto de la droga en la locomoción se oscurecerá.
      2. Tenga cuidado de no romper la superficie del agar con la selección, ya que esto permitirá a los gusanos cavar y interrumpir el ensayo. Incuba los gusanos en RT durante 30 minutos.
      3. Asegúrese de que haya un intervalo adecuado entre los inicios de cada placa. Un experimentado puede mover 40 animales, 10/anillo para 4 anillos en < 1,5 min, pero cualquier intervalo de hasta 2 minutos es aceptable. El ensayo estándar tiene películas que graban a 10-12 min y 30-32 min de exposición para etanol de 0 mM y 400 mM.
      4. Inicie la placa de aclimatación para la exposición de 0 mM y la placa de aclimatación para la exposición de 400 mM aproximadamente 2 minutos y 30 segundos de diferencia para permitir el guardado del primer archivo de película antes de que comience la segunda película.
      5. Después del período de aclimatación de 30 minutos, transfiera los gusanos de las placas de aclimatación a las placas de ensayo. Transfiera los gusanos a las placas de ensayo (etanol de 0 mM o 400 mM) en el mismo orden en que se añadieron a la placa de aclimatación, haciendo un seguimiento del tiempo entre las terminaciones de cada placa. Selle la placa con película de laboratorio para minimizar la pérdida de etanol a la vaporización.
      6. Utilice un movimiento de primicia con una selección de gusano aplanado de borde fino para recoger gusanos en la parte superior de la selección aplanada. Realizar la transferencia de gusanos de la placa de aclimatación sin semilla a la placa de ensayo sin el uso de bacterias, que se utiliza comúnmente en la transferencia de gusanos, ya que ayuda a pegar el gusano a la selección.
         NOTA: La velocidad a la que se transfieren los animales a este paso es muy importante porque los primeros gusanos de la placa estarán expuestos al etanol más tiempo que los últimos gusanos añadidos a la placa, y los puntos de tiempo anteriores pueden mostrar algunos efectos dependientes del tiempo. Esta es la razón principal para girar qué cepas se colocan en una placa primero a través de réplicas experimentales.
   3. Realizar ensayo de locomoción: Filmación
      1. Utilice una combinación de microscopio/cámara que permita la toma simultánea de imágenes de los cuatro anillos en el campo de visión (aproximadamente 42x42 mm² cuadrados), como un objetivo de microscopio de 0,5x, una ampliación de 0,8x y una cámara con un CCD de píxeles de 2048x2048 de 7,4 μm.
      2. Utilice la iluminación uniforme en todo el campo de visión, lo que ayuda en el reconocimiento de objetos en el paso umbral de intensidad. Una retroiluminación de 3"x3" funciona bien.
      3. Imagine los gusanos en una placa colocada hacia arriba (tapa hacia abajo), lo que genera contraste que se pierde cuando se utiliza la retroiluminación en comparación con una fuente de luz transmitida por microscopio tradicional.
      4. Prepare el software de análisis de imágenes para capturar películas de lapso de tiempo de los gusanos en movimiento. Establezca el software para capturar imágenes a escala de grises de 12 bits cada 1 s, como una película de 2 minutos (120 fotogramas). Para reducir el tamaño del archivo de salida, sin dejar de conservar suficiente resolución de imagen, utilice un modo de binning 2x2 para capturar imágenes de píxeles 1024x1024.
      5. Graba las películas. Comience a grabar una película de 120 fotogramas de la primera placa (etanol de 0 mM) 10 minutos después de que los últimos gusanos fueron colocados en esa placa. Guarde el archivo de película.
      6. Registre la segunda placa (etanol de 400 mM). Repita este proceso para ambas placas a partir de 30 minutos después de que los últimos gusanos se colocaron en la primera placa (etanol de 0 mM) para capturar los puntos de tiempo de 30-32 minutos para cada exposición.
         NOTA: Deje tiempo suficiente para guardar los archivos de imagen después de cada sesión de captura antes de comenzar la grabación de la siguiente placa para ser analizado.
      7. Para preparar el futuro de las películas archivadas y permitir que estas películas sean abiertas y analizadas por otros programas de software de imágenes de código abierto de dominio público, como ImageJ, convierta una copia de cada película en archivos TIFF a escala gris de 8 bits y 256.
         NOTA: El software de análisis de imágenes descrito aquí utiliza un formato de archivo propietario.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.