C. elegans Rörelsespårning: En metod för att bedöma rörelse i maskar

Overview

Den här videon beskriver användningen av video- och spårningsprogram för att spela in maskrörelser på en arena.  Exempelprotokollet mäter effekten av etanolexponering på maskrörelse.

Protocol

Följande protokoll är ett utdrag från Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Steg att utföra dagen före analysen

   1. Välj L4-scenmaskar till färska nematodtillväxtmedium (NGM) plattor sådda med en gräsmatta op50 E. colioch odla dem vid 20 °C O/N. Varje analystillstånd kräver 10 maskar; välj ett överskott av maskar för att möjliggöra O / N-förlust av maskar.
      1. Analysera endast djur som är första dagens vuxna; många mutanter växer i långsammare hastighet än vild typ. Justera tidpunkten för plockning för stammar som har utvecklingsförseningar så att alla djur som testas är första dagens vuxna.
2. Steg att utföra på testdagen
   1. Förberedelse för analysen:
      1. Utför analyser på standard osedda 60 x 15 mm NGM-plattor. Torka alla plattor som ska användas vid 37 °C i 2 timmar, med locken av. För varje försöksstudie, använd fyra torkade NGM-plattor; Dessa kommer att vara 0 mM och 400 mM etanoltestplattor och tillhörande acklimatiseringsplattor.
         OBS: Användningen av NGM-plattor är viktig här; skillnader i plattornas sammansättning, särskilt deras osmolaritet, kan starkt påverka dossvaret av etanol på beteende, detta beror åtminstone delvis på förändringar i mängden etanol som ackumuleras av djuren. NGM agar är 160 mOsm.
      2. Efter torkning, väg var och en av de osedda NGM-plattorna som ska användas i analysen och notera vikten. Bestäm medievolymen i plattorna baserat på vikten av en tom platta. För att approximera omvandlingen av agarens vikt till volym, anta att mediet väger samma som en lika stor volym vatten.
         OBS: Våra mest konsekventa resultat har hittats med NGM-media som har torkat tillräckligt för att en originalvolym på 10 ml har en volym efter torkning mellan 8,3–8,9 ml. Ett alternativ till torrtiden på 2 timmar är att torka tills plattorna når detta volymområde för att ta hänsyn till skillnader i inkubatorer.
      3. Smält 4 kopparringar (innerdiameter på 1,6 cm) i ytan på var och en av plattorna för att fungera som korraler för de olika genotyperna eller behandlingsgrupperna av maskar. Fatta tag i varje ring med tång och värm i en flamma (en stark flamma från en Bunsen-brännare fungerar bra) i cirka 3 sekunder. Placera omedelbart ringen på en tallrik medan du fortfarande håller ringen med tången för att förhindra att den "hoppar".
         1. Se till att ringen vilar platt mot agarens yta genom att försiktigt trycka ner med tången på flera punkter på ringen. När du placerar ringen, var noga med att lämna plats för ytterligare tre ringar.
         2. Smält de tre extra kopparringarna i plattans yta, var noga med att placera dem så nära varandra som möjligt så att alla fyra kommer att vara inom kamerans synfält.
            OBS: Att göra en bra tätning med agar är viktigt för att hålla maskarna i ringarna under analysen. Ringar som hoppar runt på plattan är osannolikt att göra rätt tätning med agaren och kan ärra agaren, vilket gör att maskar kan gräva och stör visualiseringen av maskarna.
         3. För varje analysplatta bered en medföljande "acklimatiseringsplatta", som ska torkas och lossas och inte får någon etanol. Placera fyra kopparringar på tallrikarna.
      4. Märk botten av plattorna bredvid varje ring med maskstammen som ska användas i ringen, var noga med att inte skriva i själva ringens synfält. Matcha etiketterna på analysplattan med dess medföljande acklimatiseringsplatta.
      5. Beräkna mängden 100% etanol för att lägga till varje analysplatta så att den slutliga koncentrationen är 0 mM eller 400 metanol (vikt till volym). För varje experiment (n = 1) kommer det att finnas en 0 mM och en 400 mM etanolplatta; acklimatiseringsplattor får inte etanol. Tillsätt etanolen och rör den runt plattans yta. Använd laboratoriefilm för att försegla plattan och låt den balansera på bänkskivan i 2 timmar.
      6. När 1,5 timmar har gått, börja acklimatiseringssteget i analysen, steg 2.2.
   2. Utför rörelseanalys: Analysplattor
      1. Överför försiktigt 10 maskar av varje experimentell grupp till mitten av en kopparring på acklimatiseringsplattan. Ta bort all mat som är synlig på agaren vid denna tidpunkt genom att skrapa försiktigt med maskplockningen. Variera i vilken ordning de experimentella grupperna sätts på plattorna över experimentella försök så att samma stammar inte läggs på plattorna i samma ordning över försök.
         OBS: Målet är att överföra djuren till tallriken med minimala mängder mat, för om mat på acklimatiseringsplattan överförs till analysplattan kommer maskarna att aggregeras runt maten och läkemedlets effekt på rörelse kommer att döljas.
      2. Var försiktig så att du inte bryter agarens yta med plocket, eftersom det gör att maskarna kan gräva och kommer att störa analysen. Inkubera maskarna på RT i 30 min.
      3. Se till att det finns ett lämpligt intervall mellan initieringarna av varje platta. En erfaren experimenterare kan flytta 40 djur, 10/ring för 4 ringar i < 1,5 min, men varje intervall upp till 2 min är acceptabelt. Standardtestet har filmer som spelar in på 10-12 min och 30-32 min exponering för både 0 mM och 400 mM etanol.
      4. Initiera acklimatiseringsplattan för 0 mM-exponeringen och acklimatiseringsplattan för 400 mM-exponeringen med ungefär 2 min och 30 sekunders mellanrum för att möjliggöra sparande av den första filmfilen innan den andra filmen måste börja.
      5. Efter acklimatiseringsperioden på 30 minuter överför du maskarna från acklimatiseringsplattorna till analysplattorna. Överför maskarna till analysplattorna (0 mM eller 400 mM etanol) i samma ordning som de tillsattes acklimatiseringsplattan och höll reda på tidpunkten mellan varje plattas färdigställande. Försegla plattan med laboratoriefilm för att minimera förlust av etanol till förångning.
      6. Använd en skopa rörelse med en tunn kantad tillplattad mask plocka för att samla maskar ovanpå den tillplattade plockningen. Utför överföringen av maskar från den osedda acklimatiseringsplattan till analysplattan utan användning av bakterier, som vanligtvis används vid överföring av maskar eftersom det hjälper till att limma masken till plockningen.
         OBS: Hastigheten med vilken djur överförs i detta steg är mycket viktig eftersom de första maskarna på plattan kommer att utsättas för etanol längre än de sista maskarna som läggs till plattan, och tidigare tidpunkter kan visa några tidsberoende effekter. Detta är den främsta orsaken till att rotera vilka stammar som placeras på en tallrik först över experimentella replikat.
   3. Utför Locomotion Assay: Filma
      1. Använd en kombination av mikroskop/kamera som möjliggör samtidig avbildning av alla fyra ringarna inom synfältet (cirka 42x42 mm² kvadrat), till exempel ett 0,5x mikroskopmål, 0,8x förstoring och en kamera med en 2048x2048 7,4 μm pixel CCD.
      2. Använd jämn belysning över synfältet, vilket hjälper till med objektigenkänning vid intensitetströskelsteget. En 3"x3" bakgrundsbelysning fungerar bra.
      3. Avbilda maskarna på en plåt placerad media-sida upp (locket ner), vilket genererar kontrast som går förlorad när du använder bakgrundsbelysningen jämfört med ett traditionellt mikroskop överförd ljuskälla.
      4. Förbered bildanalysprogramvaran för att fånga timelapse-filmer av de rörliga maskarna. Ställ in programvaran så att den tar 12-bitars gråskalebilder var 1 sekund, som en 2-minuters (120 ram) film. Om du vill minska storleken på utdatafilen, samtidigt som du behåller tillräcklig bildupplösning, använder du ett 2x2-binning-läge för att fånga 1024x1024 pixelbilder.
      5. Spela in filmerna. Börja spela in en 120-ramfilm av den första plattan (0 mM etanol) 10 min efter att de sista maskarna placerades på den plattan. Spara filmfilen.
      6. Spela in den andra plattan (400 mM etanol). Upprepa denna process för båda plattorna som börjar 30 min efter att de sista maskarna placerades på den första plattan (0 mM etanol) för att fånga de 30-32 minuters tidspunkterna för varje exponering.
         OBS: Ge tillräckligt med tid för att spara bildfilerna efter varje inspelningssession innan du börjar spela in nästa platta som ska analyseras.
      7. För framtidssäkring av arkiverade filmer och för att tillåta att dessa filmer öppnas och analyseras av andra offentliga program för öppen källkod, till exempel ImageJ, konverterar du en kopia av varje film till 8-bitars 256 TIFF-filer i grå skala.
         OBS: Bildanalysprogramvaran som beskrivs här använder ett proprietärt filformat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.