Overview
Denne video introducerer begreberne bag calcium imaging og indeholder et eksempel protokol for time-lapse billeddannelse af orme indeholdt i støbt agarose brønde.
Protocol
Denne protokol er et uddrag fra Turek et al, Agarose Microchambers for Langsigtet Calcium Imaging af Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Calcium imaging
- Brug transgene stammer, der udtrykker genetisk kodede calciumsensorer som HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Brug et sammensat mikroskop, der er udstyret til bredfelts epifluorescens. Tilslut EMCCD-kameraets TTL-udgang til LED'ens TTL-indgang, så prøven lyser, hver gang kameraet optager en ramme. Brug en eksponeringstid på ca. 5 msec. Brug EM gevinst i intervallet 50 - 300.
- Angiv en burst-film, der kører i 24 timer, hvor hver orm afbildes hvert 15. - 30. minut først i 20 sek. Brug en billedhastighed på 2/sek.
- Til visuel datainspektion skal du bruge et falsk farvekort for at øge synligheden af små ændringer i fluorescensintensiteten. Fluorescerende data for området som ΔF/F, hvor F er den gennemsnitlige basisværdi for fluorescens. En detaljeret beskrivelse af calcium dataanalyse kan findes i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
