Imágenes de calcio: un método para visualizar la actividad neuronal en Live C. elegans

Overview

Este video introduce los conceptos detrás de las imágenes de calcio e incluye un protocolo de ejemplo para la toma de imágenes de lapso de tiempo de gusanos contenidos en pozos de agarose moldeados.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. (2015).

1. Imágenes de calcio

1. Utilice cepas transgénicas que expresen sensores de calcio genéticamente codificados como HBR16(goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
2. Utilice un microscopio compuesto equipado para la epifluorescencia de campo ancho. Conecte la salida TTL de la cámara EMCCD a la entrada TTL del LED, de modo que cada vez que la cámara registre un fotograma se ilumine la muestra. Utilice un tiempo de exposición de unos 5 msec. Utilice la ganancia em en el rango de 50 - 300.
3. Especifique una película de ráfaga que se ejecute durante 24 horas con cada gusano que se imagine cada 15 - 30 minutos primero durante 20 s con DIC, luego durante 20 s con una fluorescencia GFP para grabar GCaMP, y luego tome una imagen final de la señal mKate2 se toma para controlar los niveles de expresión. Utilice una velocidad de fotogramas de 2/s durante cada ráfaga.
4. Para la inspección visual de datos, utilice un mapa de color falso para mejorar la visibilidad de pequeños cambios en la intensidad de la fluorescencia. Trace datos fluorescentes como ΔF/F, siendo F el valor basal medio de la fluorescencia. Puede encontrar una descripción detallada del análisis de datos de calcio en la literatura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LED system	CoolLED	pE-2
Compound microscope	Nikon	TiE
EMCCD camera	Andor	iXon 897	now sold as iXon Ultra 897
Z-stage for the microscope	Prior	Nano Scan Z
X-Y stage for the microscope	Prior	Proscan III
Red light filter	Chroma	ET660/50m
35 mm Petri dish	Falcon	Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning