Overview
यह वीडियो कैल्शियम इमेजिंग के पीछे की अवधारणाओं का परिचय देता है और इसमें ढाला हुआ एगर उठे कुओं में निहित कीड़े के समय-चूक इमेजिंग के लिए एक उदाहरण प्रोटोकॉल शामिल है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल ट्यूरेक एट अल से एक अंश है,जो कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस,जे विस एक्सपी के दीर्घकालिक कैल्शियम इमेजिंग के लिए एगरजर्ज माइक्रोचेम्बर्स है। (2015).
1. कैल्शियम इमेजिंग
- इस तरह के HBR16(goeIs5 [pnmr-1:: SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर व्यक्त ट्रांसजेनिक उपभेदों का उपयोग करें ।
- चौड़े क्षेत्र के एपिफ्लोरेसेंस के लिए सुसज्जित यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। ईएमसीसीडी कैमरे के टीटीएल आउटपुट को एलईडी के टीटीएल इनपुट से कनेक्ट करें, ताकि हर बार कैमरा एक फ्रेम रिकॉर्ड करे नमूना प्रकाशित हो जाएगा। लगभग 5 मेससेक के एक्सपोजर समय का उपयोग करें। 50 - 300 की सीमा में EM लाभ का उपयोग करें।
- प्रत्येक कीड़ा के साथ 24 घंटे के लिए चल रही एक फट फिल्म निर्दिष्ट डीआईसी के साथ 20 सेकंड के लिए हर 15-30 मिनट पहले छवि जा रहा है, तो GCaMP रिकॉर्ड करने के लिए एक GFP फ्लोरेसेंस के साथ 20 सेकंड के लिए, और फिर mKate2 संकेत की एक अंतिम छवि लेने के लिए अभिव्यक्ति के स्तर के लिए नियंत्रण लिया जाता है । प्रत्येक फट के दौरान 2/सेकंड की फ्रेम दर का उपयोग करें ।
- दृश्य डेटा निरीक्षण के लिए, फ्लोरेसेंस तीव्रता में छोटे परिवर्तनों की दृश्यता को बढ़ाने के लिए एक झूठे रंग के नक्शे का उपयोग करें। प्लॉट फ्लोरोसेंट डेटा के रूप में एंफ/एफ, एफ फ्लोरेसेंस का औसत आधारभूत मूल्य होने के साथ। साहित्य में कैल्शियम डेटा विश्लेषण का विस्तृत विवरण पाया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
