Overview
Denna video introducerar begreppen bakom kalciumavbildning och innehåller ett exempelprotokoll för timelapse-avbildning av maskar som finns i gjutna agarosabrunnar.
Protocol
Detta protokoll är ett utdrag från Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Kalciumavbildning
- Använd transgena stammar som uttrycker genetiskt kodade kalciumsensorer som HBR16(goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Använd ett sammansatt mikroskop som är utrustat för epifluorescens med bred fält. Anslut TTL-utgången för EMCCD-kameran till LYSDIODENS TTL-ingång, så att varje gång kameran spelar in en bildruta kommer provet att belysas. Använd en exponeringstid på ca 5 msec. Använd EM-förstärkning i intervallet 50 -300.
- Ange en burst-film som körs i 24 timmar med varje mask som avbildas var 15: e till 30:e minut först i 20 sekunder med DIC, sedan i 20 sekunder med en GFP-fluorescens för att spela in GCaMP och ta sedan en slutlig bild av mKate2-signalen tas för att styra för uttrycksnivåer. Använd en bildhastighet på 2/sek under varje burst.
- För visuell datainspektion, använd en falsk färg karta för att förbättra synligheten för små förändringar i fluorescens intensitet. Rita fluorescerande data som ΔF/F, där F är fluorescensens genomsnittliga baslinjevärde. En detaljerad beskrivning av kalcium data analys finns i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
