A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
5.1K views
⸱
April 30th, 2023
Kaynak: Farboud, B. ve diğerleri, Çeşitli Hücrelerde ve Organizmalarda Cas9 Ribonükleoprotein ile Gelişmiş Genom Düzenleme.J. Vis. Uzm. (2018).
Bu videoda, transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR bazlarının gen düzenlemesi için bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonu göreceğiz.
Aşağıdaki protokol, Farboud ve ark. Çeşitli Hücrelerde ve Organizmalarda Cas9 Ribonükleoprotein ile Gelişmiş Genom Düzenleme, J. Vis. Exp.(2018).
1. RNP Derlemesi
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Tablo 1: Ön genom düzenleme deneyleri için pozitif kontroller.Bu tablo, bu protokolde açıklanan hücre ve organizmaların her birinde ilk kez genom düzenleme deneyi gerçekleştirmek için gereken temel bilgileri göstermektedir. Bu parametrelerin takip edilmesinin, protokolü test etmek için kullanılabilecek veya deneyci kendi ilgi alanlarına giren bir geni hedefledikten sonra karşılaştırma için bir temel olarak.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| >Reaktifler/Malzemeler | |||
| DNA oligonükleotidleri | Entegre DNA Teknolojileri | - | IDT, Tablo 1'dekiler de dahil olmak üzere özel DNA dizileri sağlayacaktır |
| Guide RNA'lar | Synthego | - | Synthego, Tablo 1'de yer alan hedefleme dizilerini içeren özel sgRNA'lar da dahil olmak üzere S. pyogenes Cas9 için yüksek kaliteli sgRNA'lar sağlayacaktır |
| Saflaştırılmış Cas9 proteini (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | Mümkünse, Cas9'u şirket içinde saflaştırmak veya yerel çekirdek tesislerden satın almak daha ucuz bir seçenektir |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetik Merkezi | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri kapları | - | - | Bkz. Stiernagle, T (ref. 59) |
| Filamentli standart borosilikat cam kılcal damarlar: 4 inç (100 mm), 1/0,58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Tek namlulu standart borosilikat cam kılcal damarlar: 6 inç (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Kapak camı; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Kapak camı; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plazmidi | Addgene | 19327 | |
| Filamentli kılcal borular: 4 inç (1,0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri kapları (100 × 15 mm) | - | ||
| 9" pastör pipetleri | - | ||
| Nukalaz içermeyen su | - | ||
| Ekipman | |||
| MZ75 Stereomikroskop | Leica | Üretim dışı. Mevcut model M80 Stereomikroskop'tur | |
| Axio Vert35 ters faz kontrastlı floresan mikroskop | Zeiss | Üretim dışı. Mevcut model Axio VertA'dır.1 | |
| Lazer tabanlı mikropipet çektirme (C. elegans protokolü için) | Sutter Enstrümanı | FG-P2000 | |
| Pikolitre Mikroenjektör (C. elegans protokolü için) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Üç eksenli Joystick yağ hidrolik mikromanipülatörü | Narishige International | MO-202U | |
| Kaba manipülatör | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipet uçları | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
