Microinyección de Gonad: Un método de entrega compuesta directamente en la línea germinosa de C. elegans

Overview

Este video describe la microinjección, un método común de creación de cepas transgénicas de C. elegans.   En el ejemplo, veremos microinyección utilizada para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes de bases CRISPR.

Protocol

El siguiente protocolo es un extracto de Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018).

1. Asamblea RNP

1. Diseñe el experimento con mucha antelación, adquiriendo todos los componentes de ARN, ADN y proteínas con anticipación. Como primer paso, pruebe uno de los controles positivos enumerados en el Cuadro 1 y utilice los reactivos comerciales descritos en la Tabla de Materiales para garantizar un diseño experimental fiable y la integridad de los materiales. Para obtener consejos adicionales sobre la planificación de un nuevo experimento de edición del genoma, consulte los documentos sobre este tema.
   NOTA: Una vez ensamblados como se describe en los pasos posteriores, los RNPs preparados con antelación pueden almacenarse a -80 °C.
   1. Después de elegir a qué gen dirigirse, utilice una de las herramientas en línea gratuitas para diseñar un ARN óptimo. Asegúrese de apuntar a un exon si espera generar un nocaut.
      NOTA: Estas herramientas ayudarán a identificar un sitio de destino con una secuencia PAM adyacente de S. pyogenes, una puntuación de alta calidad y una puntuación baja fuera del objetivo.
   2. Purificar la proteína S. pyogenes Cas9 a través de métodos publicados o comprarla a un proveedor comercial.
   3. Prepare un búfer Cas9 típico para la dilución de ARN, preparación RNP y almacenamiento de proteínas, que contiene 20 mM de HEPES pH 7.5, 150 mM de KCl, 10% de glicerol y 1 mM de TCEP. Utilice siempre agua libre de nucleasa en tampones que se utilizarán para resuspend o diluir el ARN para evitar la degradación.
   4. Producir el ARN guía (tracrRNA y crRNA o sgRNA) a través de una transcripción in vitro utilizando métodos publicados, o comprarlo de una empresa de síntesis de ácido nucleico.
   5. Si inserta un gen, sintetiza o compra una plantilla de ADN de donante.
   6. Almacene las proteínas y los coácuotas de ARN a -80 °C y descongele el hielo inmediatamente antes de su uso.
      NOTA: Cada congelación-deshielo reduce ligeramente la eficiencia. Protocolos detallados de acceso abierto para la purificación Cas9 y la transcripción in vitro de los sgRNAs están disponibles en otros lugares.
2. Preparación RNP para C. edición de elegans: Montar el complejo RNP añadiendo los siguientes reactivos con el fin de crear un volumen final de 20 μL (las concentraciones finales se observan entre paréntesis): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7.5 (10 μM KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) y las plantillas de reparación si es necesario (SsDNA de 0,5 μM o hasta 350 ng/μL dsDNA).
   NOTA: La eficiencia de una reparación con plantilla DSB mediada por Cas9 es proporcional a la concentración de la construcción de reparación dsDNA; por lo tanto, cuanto mayor sea la concentración de la plantilla de reparación, más eficiente será la reparación con plantilla. Sin embargo, se ha demostrado que una inyección de mezclas que contienen más de 350 ng/μL de dsDNA reduce la viabilidad de los gusanos inyectados. Por lo tanto, lo mejor es utilizar hasta, pero no más de 350 ng / μL de dsDNA en la mezcla para maximizar la eficiencia de reparación mientras minimiza su letalidad.
   1. Agregue varios CRRNAs para dirigirse a múltiples loci simultáneamente, según sea necesario para el enfoque de cribado de co-CRISPR/co-conversión. Al agregar más de un CRRNA, agregue cada uno secuencialmente a la mezcla maestra.
      NOTA: La cantidad de cada CRRNA no tiene por qué ser la misma, e incluso duplicar la concentración total de CRRNAs en la mezcla maestra sin cambiar la concentración de Cas9 no parece interferir con la frecuencia de mutagénesis en un locus específico. Algunos ejemplos se describen en detalle en Paix et al.
   2. Mezcle mediante pipeteo y gire la solución RNP a 16.000 x g durante 5 s para asegurarse de que la solución se recoge en la parte inferior del tubo.
   3. Incubar la solución a 37 °C durante 15 m.
   4. Centrífuga la muestra a 16.000 x g durante 1 minuto para peletizar cualquier partícula que pueda obstruir la aguja de microinyección finamente aburrida. Utilice el sobrenadante en los pasos siguientes.
3. Preparación de C. elegans

1. 1 día antes de la microinyección: Prepare las almohadillas de agarose para la microinyección.

1. Haga una solución de agarose del 3% (w/v) en agua añadiendo agarose al agua y llevando la solución a ebullición en un plato caliente o en un microondas.
2. Coloque 24 mm x 50 mm x 1,5 mm de portaobjetos de vidrio de cubierta en una mesa y utilice una pipeta Pasteur de vidrio para colocar una pequeña gota (~15 μL) de solución de agarose en el tobogán. Aplane rápidamente la caída de la agarose colocando otra mancha en la parte superior. Deje que la agarose se solidifique y luego retire uno de los puntos de cubierta.
3. Deje que el cubrecubres recubierto de agarose esté boca arriba en una mesa durante la noche para secar. Después de las 24 h, guarde las almohadillas de agarose en un recipiente limpio y seco.
   NOTA: Estos se pueden utilizar indefinidamente.

2. Tire de las agujas de microinjección: utilizando capilares de vidrio borosilicato con filamentos (diámetro exterior 1,0 mm y diámetro interior 0,58 mm), tire de las agujas basadas en Mello y Fuego⁵⁷ y otros recursos. Las agujas se pueden utilizar inmediatamente o se pueden almacenar en un recipiente limpio y seco, preparado por soportes de arcilla.

3. Para el mantenimiento de los gusanos, prepare un agar Nematode Growth Media (NGM) vertido en placas Petri y detectado con bacterias OP50 (para protocolos sobre mantenimiento estándar C. elegans y recetas para medios de crecimiento, véase Stiernagle).

4. Escenifique los gusanos para la microinjección: 12-24 h antes de la microinjección, elija hermafroditas escenificadas en L4 a una nueva placa de agar NG con bacterias OP50 e incubarlos durante la noche a 20 °C. Para cada mezcla de destino/inyección cas9, elija ~30 gusanos en la placa.

4. Día de microinyección: Cargue la aguja de microinyección extraída con el sobrenadante de solución RNP preparado en el paso 1.2.
   1. Pipetear el sobrenadante del paso 1.2.4 en una pipeta capilar extraída y rellenar la solución de la pipeta capilar en la aguja de microinjección preparada (generalmente cargando menos de 0,1 μL).
5. Monte la aguja cargada en el aparato de microinjección unido a un micromanipulador. Ajuste la presión del aparato de inyección a 250 kPa y la presión de equilibrio a 25 kPa.
6. Rompa la punta de la aguja cargada para generar un borde afilado de la aguja. Coloque un clip de cubierta cuadrado de 15 mm x 15 mm x 1,5 mm en la parte superior de una funda de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
   1. Superponga un borde de la cubierta cuadrada con aceite de halocarbono 700.
   2. Coloque la aguja en el aceite, en el borde de la cubierta cuadrada de 15 mm.
   3. Usando una mano para guiar la etapa del microscopio y el deslizamiento de las cubiertas, cepille la diapositiva hacia arriba y a lo largo del borde de la aguja mientras deprime el pedal/botón de inyección. Rompa la punta de la aguja hacia atrás, aumentando el flujo del líquido fuera de la aguja. Lograr un caudal óptimo haciendo que la mezcla de inyección fluya a lo largo del borde de la aguja, formando ~1 burbuja/s.
7. Confirme que los gusanos L4 recogidos 12-24 h antes de la microinyección son adultos jóvenes organizados por el desarrollo el día de la inyección. Elige los gusanos adultos jóvenes en una placa de agar NG que carece de bacterias OP50 y deja que se arrastren durante 5 minutos. Esto reduce la cantidad de bacterias transferidas a la almohadilla de inyección, minimizando las obstrucciones de las agujas.
8. Coloque una almohadilla/cubierta de inyección de agarose en un visor de disección. Usando una selección de gusano, poner una pequeña pista de aceite de halocarbono a lo largo de un borde de la almohadilla.
9. Usando el pico de gusano recubierto de aceite, levante varios gusanos de la placa de agar NG y en la pista de aceite. Con un pelo fino unido a una pipeta, como una pestaña o bigote de gato, coloque los gusanos en paralelo, empujando suavemente los gusanos en la almohadilla de agarose. Hasta que se sienta cómodo con el procedimiento de microinjección, solo monte e inyecte un gusano a la vez.
   NOTA: La agarose seca absorbe la humedad de los gusanos, haciendo que se adhieran a la almohadilla. Por lo tanto, uno debe trabajar rápidamente ya que los gusanos pueden desecar.
   1. Una vez en posición y unido a la almohadilla, superponga los gusanos con otras gotas de aceite de halocarbono (~20 μL) de la punta de la selección de gusanos.
10. C. elegans Gonad Microinjection con RNPs y Atención postinyección
    El protocolo de microinyección está adaptado de Mello y Fire y descrito en detalle en otros lugares.
    1. Coloque el control de cubierta con los gusanos montados en el microscopio de inyección. Bajo una baja ampliación (objetivo 5X, ocular 10X), coloque los gusanos perpendiculares a la aguja de inyección.
       1. Cambie a una ampliación alta (objetivo 40X, ocular 10X), reposicione la aguja adyacente al brazo gonad correspondiente a la región cerca de los núcleos en paquiteno medio a tardío.
       2. Usando el micromanipulador, mueva la aguja contra el gusano, deprimiendo ligeramente la cutícula. Luego, con una mano, toque el lado de la etapa del microscopio para sacudir la aguja a través de la cutícula. Deprima el pedal/botón de inyección y llene lentamente el brazo de la gónada con la mezcla de inyección y retire la aguja.
       3. Repita este paso con el otro brazo gonad.
    2. Una vez inyectados los gusanos, retire la almohadilla de deslizamiento/agarose y colóquela bajo un microscopio diseccionador.
       1. Usando una pipeta capilar tirada, desplazar el aceite de los gusanos pipeteando un amortiguador M9 sobre ellos. Realice este tratamiento para liberar los gusanos del agar.
       2. Después de 10 minutos, cuando los gusanos estén golpeando en el amortiguador, muévalo a una placa de agar NG con bacterias OP50 usando la pipeta capilar extraída. Coloque la placa a 20 °C durante 2-3 h hasta que los gusanos se hayan recuperado y se muevan.
    3. Una vez recuperados, transfiera individualmente los gusanos a placas de agar NG con OP50 y transfiera las placas a una incubadora de 25 °C.
    4. Deje que losgusanos inyectados P₀crezcan y dejen la progenie durante 3 días. Examina a la descendencia F_1.
       1. Si utiliza co-CRISPR o co-conversión, seleccione los gusanos candidatos para la detección en función de si tienen el fenotipo mutante del gen de referencia. Transfiera individualmente estos gusanos marcados a nuevas placas de agar NG con OP50 y déjenlos poner la progenie F₂ a 20 °C.
          NOTA: El fenotipo utilizado para una cribado o selección co-CRISPR debe proporcionar una estimación temprana para el éxito de la edición Cas9.
       2. Si el fenotipo co-CRISPR no está presente, microinyecto un plásmido de control positivo para ayudar a mejorar la eficiencia de la microinjección.
          NOTA: Por ejemplo, incluir un plásmido en la mezcla de inyección que codifica MYO-2 con etiqueta mCherry ayudará a evaluar la eficiencia de la inyección. Los gusanos inyectados con éxito con pCFJ90 tendrán alguna descendencia con faringe fluorescente.
    5. Examine los gusanos F₁ para la presencia de las ediciones deseadas. Elija a la madre F₁ en un pozo individual de una placa de 96 pozos, lílicela y examine su ADN mediante la amplificación de PCR específica de la plaquita, el análisis de secuencias de ADN o el ensayo de nucleasa del topógrafo (CEL-1).
       NOTA: Estos ensayos se pueden realizar cuando se utiliza una co-CRISPR/co-conversión u otros regímenes de selección o cribado.

Representative Results

Tabla 1: Controles positivos para experimentos preliminares de edición del genoma. Esta tabla muestra la información clave necesaria para realizar un experimento de edición del genoma por primera vez en cada una de las células y organismos descritos en este protocolo. Seguir estos parámetros es probable que produzca un resultado exitoso que se pueda utilizar para probar el protocolo o como línea base para la comparación una vez que el experimentador se dirige a un gen de su propio interés. F: adelante, R: reverso, HDR: reparación dirigida por homología. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar