Микроинъекция Гонада: Метод доставки соединения непосредственно в зародыш C. elegans

Abstract

Источник: Farboud, B. et al, Улучшенная редактирование генома с Cas9 Ribonucleoprotein в различных клетках и организмах. J. Vis. Exp. (2018). 

Это видео описывает микроинъекции, распространенный метод создания трансгенных штаммов C. elegans.   В этом примере мы увидим микроинъекцию, используемую для внедрения комплекса рибонуклеопротеина (RNP) для редактирования генов CRISPR-баз.

Protocol

Следующий протокол является выдержка из Farboud и др., Улучшенная редактирование генома с Cas9 Ribonucleoprotein в различных клеток и организмов, J. Vis. Exp. (2018). 1. Ассамблея РНП Разработать эксперим…

Representative Results

Таблица 1: Положительные элементы управления для предварительных экспериментов по редактированию генома. В этой таблице показана ключевая информация, необходимая для проведения первого эксперимента по редактированию ге?…

Materials

Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	–	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	–	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	–	–	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	–
9" pasteur pipettes	–
Nuclease-free water	–
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar