Gonad Microinjection: Eine Methode der zusammengesetzten Lieferung direkt in die Keimbahn von C. elegans

Overview

Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Schaffung transgener C. elegans-Stämme.   Im Beispiel sehen wir, wie Mikroinjektionverwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die GENbearbeitung von CRISPR-Basen einzuführen.

Protocol

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018).

1. RNP-Baugruppe

1. Entwerfen Sie das Experiment rechtzeitig und erwerben Sie alle RNA-, DNA- und Proteinkomponenten im Voraus. Versuchen Sie zunächst eine der in Tabelle 1 aufgeführten positivsten Kontrollen und verwenden Sie die in der Materialtabelle beschriebenen kommerziellen Reagenzien, um ein zuverlässiges experimentelles Design und die Integrität der Materialien zu gewährleisten. Weitere Tipps zur Planung eines neuen Genombearbeitungsexperiments finden Sie in den Beiträgen zu diesem Thema.
   HINWEIS: Nach der Montage, wie in den folgenden Schritten beschrieben, können im Voraus vorbereitete RNPs bei -80 °C gelagert werden.
   1. Nachdem Sie sich für das Ziel des Gens entschieden haben, verwenden Sie eines der kostenlosen Online-Tools, um eine optimale gRNA zu entwerfen. Achten Sie darauf, ein Exon zu zielen, wenn Sie hoffen, einen Knockout zu generieren.
      HINWEIS: Diese Tools helfen, eine Zielstelle mit einer benachbarten S. pyogenes PAM-Sequenz, einer qualitativ hochwertigen Punktzahl und einer niedrigen Off-Target-Bewertung zu identifizieren.
   2. Reinigen Sie das S. pyogenes Cas9 Protein durch veröffentlichte Methoden oder kaufen Sie es von einem kommerziellen Anbieter.
   3. Bereiten Sie einen typischen Cas9-Puffer für die RNA-Verdünnung, DIE RNP-Präparation und die Proteinspeicherung vor, der 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10% Glycerin und 1 mM TCEP enthält. Verwenden Sie immer nukleasefreies Wasser in Puffern, die verwendet werden, um RNA wieder zu suspendieren oder zu verdünnen, um einen Abbau zu verhindern.
   4. Produzieren Sie die Guide-RNA (tracrRNA und crRNA oder sgRNA) durch eine In-vitro-Transkription mit veröffentlichten Methoden oder kaufen Sie sie von einem Nukleinsäuresynthese-Unternehmen.
   5. Wenn Sie ein Gen einfügen, synthetisieren oder kaufen Sie eine Spender-DNA-Vorlage.
   6. Das Protein und die RNA-Aliquots bei -80 °C aufbewahren und unmittelbar vor dem Gebrauch auf Eis auftauen.
      HINWEIS: Jedes Gefriertau senkt die Effizienz leicht. Detaillierte Open-Access-Protokolle für die Cas9-Reinigung und die In-vitro-Transkription von sgRNAs sind an anderer Stelle verfügbar.
2. RNP-Vorbereitung für C. elegans-Bearbeitung: Montieren Sie den RNP-Komplex durch Zugabe der folgenden Reagenzien, um ein Endvolumen von 20 l zu erzeugen (die Endkonzentrationen sind in Klammern angegeben): Cas9 (2 m), HEPES pH 7,5 (10 KCl (115 M), crRNA (12 M), tracrRNA (40 M) und die Reparaturvorlagen bei Bedarf (0,5 m ssDNA oder bis zu 350 ng/l dsDNA).
   HINWEIS: Die Effizienz einer Von Cas9-vermittelten DSB-Schablonenreparatur ist proportional zur Konzentration des dsDNA-Reparaturkonstrukts; Je höher also die Konzentration der Reparaturschablonen, desto effizienter die Vorlagenreparatur. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine Injektion von Mischungen, die mehr als 350 ng/l dsDNA enthalten, die Lebensfähigkeit der injizierten Würmer verringert. Daher ist es am besten, bis zu, aber nicht mehr als 350 ng / l dsDNA in der Mischung zu verwenden, um die Reparatureffizienz zu maximieren und gleichzeitig seine Letalität zu minimieren.
   1. Fügen Sie mehrere crRNAs hinzu, um mehrere Loci gleichzeitig anzuvisieren, je nach Bedarf für den Co-CRISPR/Co-Conversion-Screening-Ansatz. Wenn Sie mehr als eine crRNA hinzufügen, fügen Sie jede sequenziell zum Master-Mix hinzu.
      HINWEIS: Die Menge jeder crRNA muss nicht gleich sein, und selbst die Verdoppelung der Gesamtkonzentration von crRNAs im Master-Mix, ohne die Konzentration von Cas9 zu ändern, scheint die Häufigkeit der Mutagenese an einem bestimmten Ort nicht zu beeinträchtigen. Beispiele werden in Paix et al. ausführlich beschrieben.
   2. Mischen Sie die RNP-Lösung mit 16.000 x g für 5 s, um sicherzustellen, dass die Lösung an der Unterseite des Rohres gesammelt wird.
   3. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 °C für 15 m.
   4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 1 min, um Partikel, die die dünn gebohrte Mikroinjektionsnadel verstopfen könnten, zu pellet. Verwenden Sie den Überstand in den folgenden Schritten.
3. C. elegans Vorbereitung

1. 1 Tag vor der Mikroinjektion: Bereiten Sie die Agarose-Pads für die Mikroinjektion vor.

1. Machen Sie eine 3% (w/v) Agarose-Lösung in Wasser, indem Sie Agarose zu Wasser hinzufügen und die Lösung auf einer Kochplatte oder in einer Mikrowelle zum Kochen bringen.
2. Ordnen Sie 24 mm x 50 mm x 1,5 mm Abdeckung Glasschlitten auf einem Tisch an und verwenden Sie eine Glas-Pasteur-Pipette, um einen kleinen Tropfen Agarose-Lösung auf dem Dia zu platzieren. Den Agarose-Abfall schnell abflachen, indem man einen weiteren Coverslip oben auflegt. Lassen Sie die Agarose verfestigen und entfernen Sie dann eine der Abdeckungen.
3. Lassen Sie den agarosebeschichteten Coverslip über Nacht verdeckt auf einer Tischplatte zum Trocknen. Nach 24 h die Agarose-Pads in einem sauberen, trockenen Behälter aufbewahren.
   HINWEIS: Diese können auf unbestimmte Zeit verwendet werden.

2. Ziehen Sie die Mikroinjektionsnadeln: mit Borosilikatglaskapillaren mit Filamenten (Außendurchmesser 1,0 mm und Innendurchmesser 0,58 mm), ziehen Sie die Nadeln auf Basis von Mello und Fire⁵⁷ und anderen Ressourcen. Die Nadeln können sofort verwendet oder in einem sauberen, trockenen Behälter gelagert werden, der mit Tonträgern gespannt ist.

3. Für die Pflege der Würmer, bereiten Sie einen Nematode Growth Media (NGM) Agar in Petriplatten gegossen und mit OP50 Bakterien gefleckt (für Protokolle über Standard C. elegans Wartung und Rezepte für Wachstumsmedien, siehe Stiernagle).

4. Die Würmer für die Mikroinjektion inszenieren: 12-24 h vor der Mikroinjektion, L4-inszenierte Hermaphrodite auf eine neue NG-Agar-Platte mit OP50-Bakterien pflücken und sie über Nacht bei 20 °C bebrüten. Für jede Cas9-Ziel-/Injektionsmischung sollten Sie 30 Würmer auf die Platte pflücken.

4. Tag der Mikroinjektion: Laden Sie die gezogene Mikroinjektionsnadel mit dem in Schritt 1.2 vorbereiteten RNP-Lösungsüberstand.
   1. Den Überstand von Schritt 1.2.4 in eine gezogene Kapillarpipette zerkleinern und die Lösung von der Kapillarpipette in die vorbereitete Mikroinjektionsnadel (in der Regel belastung weniger als 0,1 l) nachfüllen.
5. Montieren Sie die geladene Nadel an dem Mikroinjektionsgerät, das an einem Mikromanipulator befestigt ist. Stellen Sie den Druck des Injektionsgeräts auf 250 kPa und den Ausgleichsdruck auf 25 kPa ein.
6. Brechen Sie die geladene Nadelspitze zurück, um eine scharfe Nadelkante zu erzeugen. Legen Sie einen 15 mm x 15 mm x 1,5 mm quadratischen Abdeckslip auf die Oberseite eines 24 mm x 50 mm x 1,5 mm Abdeckzettels.
   1. Überlagern Sie eine Kante des quadratischen Coverslips mit Halocarbonöl 700.
   2. Positionieren Sie die Nadel im Öl am Rand des 15 mm quadratischen Deckels.
   3. Bürsten Sie mit einer Hand die Mikroskopstufe und den Deckel, bürsten Sie den Schlitten nach oben und entlang der Nadelkante, während Sie das Injektionspedal/den Einspritzknopf drücken. Brechen Sie die Nadelspitze zurück, wodurch der Flüssigkeitsfluss aus der Nadel herauserhöht wird. Erzielen Sie eine optimale Durchflussrate, indem Sie die Injektionsmischung entlang der Nadelkante nach oben fließen lassen und dabei eine Blase/s bilden.
7. Bestätigen Sie, dass die L4-Würmer, die 12-24 h vor der Mikroinjektion gepflückt wurden, am Tag der Injektion entwicklungsisch inszenierte junge Erwachsene sind. Wählen Sie die jungen erwachsenen Würmer auf eine NG-Agar-Platte, die OP50-Bakterien fehlt, und lassen Sie sie für 5 min herumkriechen. Dies reduziert die Menge der Bakterien, die auf das Injektionspad übertragen werden, wodurch Nadelholzverstopfte minimiert werden.
8. Legen Sie ein Agarose-Injektionspad/Coverslip auf einen Sezierbereich. Legen Sie mit einem Wurmpick eine kleine Spur von Halocarbonöl entlang einer Kante des Pads.
9. Heben Sie mit dem mit Öl beschichteten Wurmpick mehrere Würmer von der NG-Agar-Platte in die Ölspur. Mit einem feinen Haar, das an einer Pipette befestigt ist, wie z. B. eine Wimpern- oder Katzenschnurrbart, positionieren Sie die Würmer parallel und schieben Sie die Würmer sanft in das Agarose-Pad. Bis sie sich mit dem Mikroinjektionsverfahren wohlfühlen, nur einen Wurm nach dem anderen montieren und injizieren.
   HINWEIS: Die trockene Agarose leitet die Feuchtigkeit der Würmer ab, wodurch sie am Pad haften. Folglich muss man schnell arbeiten, da die Würmer auslöschen können.
   1. Sobald Sie in Position sind und am Pad befestigt sind, überlagern Sie die Würmer mit weiteren tropfen Halocarbonöl (ca. 20 l) von der Spitze des Wurmpflückens.
10. C. elegans Gonad Microinjection mit RNPs und Post-Injection Care
    Das Mikroinjektionsprotokoll wurde von Mello und Fire adaptiert und an anderer Stelle ausführlich beschrieben.
    1. Legen Sie den Deckelmit den montierten Würmern auf das Injektionsmikroskop. Unter einer geringen Vergrößerung (5X Objektiv, 10X Okular) positionieren Sie die Würmer senkrecht zur Injektionsnadel.
       1. Wechseln Sie zu einer hohen Vergrößerung (40X Objektiv, 10X Okulator), positionieren Sie die Nadel neben dem Gonadenarm entsprechend der Region in der Nähe der Kerne in der Mitte bis spät-pachyten.
       2. Mit dem Mikromanipulator bewegen Sie die Nadel gegen den Wurm und drücken Sie die Nagelhaut leicht. Tippen Sie dann mit einer Hand auf die Seite der Mikroskopstufe, um die Nadel durch die Nagelhaut zu ziehen. Drücken Sie das Injektionspedal/den Knopf und füllen Sie den Gonadenarm langsam mit der Injektionsmischung und entfernen Sie die Nadel.
       3. Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem anderen Gonadenarm.
    2. Sobald die Würmer injiziert sind, entfernen Sie das Coverslip/Agarose-Pad und legen Sie es unter ein Sezierendes Mikroskop.
       1. Mit einer gezogenen Kapillarpipette das Öl aus den Würmern verdrängen, indem sie einen M9-Puffer über sie pfeifen. Führen Sie diese Behandlung durch, um die Würmer aus dem Agar zu befreien.
       2. Nach 10 min, wenn die Würmer im Puffer herumtollen, bewegen Sie sie mit der gezogenen Kapillarpipette auf eine NG-Agar-Platte mit OP50-Bakterien. Legen Sie die Platte bei 20 °C für 2-3 h, bis sich die Würmer erholt haben und sich bewegen.
    3. Nach der Wiederverergung die Würmer einzeln auf NG-Agarplatten mit OP50 übertragen und die Platten in einen 25 °C-Inkubator übertragen.
    4. Lassen Sie die P₀-injizierten Würmer wachsen und legen Nachkommen für 3 Tage. Schirmen Sie den F 1-Nachwuchs.
       1. Wenn Sie Co-CRISPR oder Co-Conversion verwenden, wählen Sie die Kandidatenwürmer für das Screening aus, je nach, ob sie den mutierten Phänotyp des Referenzgens aufweisen. Diese markierten Würmer einzeln auf neue NG-Agarplatten mit OP50 übertragen und F_2-Nachkommen bei 20 °C verlegen lassen.
          HINWEIS: Der Phänotyp, der für ein Co-CRISPR-Screening oder eine Co-CRISPR-Auswahl verwendet wird, sollte eine frühe Schätzung für den Erfolg der Cas9-Bearbeitung liefern.
       2. Wenn der Co-CRISPR-Phänotyp nicht vorhanden ist, mikroinjizieren Sie ein positives Kontrollplasmid, um die Mikroinjektionseffizienz zu verbessern.
          HINWEIS: Zum Beispiel, die Aufnahme eines Plasmids in den Injektionsmix, der mCherry-getaggt MYO-2 kodiert, wird helfen, die Injektionseffizienz zu bewerten. Würmer, die erfolgreich mit pCFJ90 injiziert wurden, werden einige Nachkommen mit fluoreszierenden Pharynxen haben.
    5. Untersuchen Sie die_F1-Würmer auf das Vorhandensein der gewünschten Bearbeitungen. Wählen Sie die_F1-Mutter an einen individuellen Brunnen einer 96-Well-Platte, lysieren Sie sie und untersuchen Sie ihre DNA entweder durch insert-spezifische PCR-Verstärkung, DNA-Sequenzanalyse oder Vermessungsnuklease-Assay (CEL-1).
       HINWEIS: Diese Assays können durchgeführt werden, wenn sie ein Co-CRISPR/Co-Conversion oder andere Screening- oder Selektionsregime verwenden.

Representative Results

Tabelle 1: Positive Kontrollen für vorläufige Genombearbeitungsexperimente. Diese Tabelle zeigt die wichtigsten Informationen, die für die Durchführung eines ersten Genombearbeitungsexperiments in jeder der in diesem Protokoll beschriebenen Zellen und Organismen erforderlich sind. Das Folgen dieser Parameter wird wahrscheinlich zu einem erfolgreichen Ergebnis führen, das verwendet werden kann, um das Protokoll zu testen oder als Vergleichsbasis, sobald der Experimentator auf ein Gen von eigenem Interesse abzielt. F: vorwärts, R: umgekehrt, HDR: homologiegesteuerte Reparatur. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar