Gonad Microinjection: En metod för sammansatt leverans direkt i germline av C. elegans

Overview

Denna video beskriver microinjection, en vanlig metod för att skapa transgena C. elegans stammar.  I exemplet kommer vi att se mikroinjektion som används för att introducera ett ribonukleoproteinkomplex (RNP) komplex för CRISPR-baser genredigering.

Protocol

Följande protokoll är ett utdrag från Farboud et al, Enhanced Genome Editing med Cas9 Ribonucleoprotein i Olika celler och organismer, J. Vis. Exp. (2018).

1. RNP-montering

1. Designa experimentet i god tid och förvärva alla RNA-, DNA- och proteinkomponenter i förväg. Som ett första pass kan du prova en av de positiva kontrollerna som anges i tabell 1 och använda de kommersiella reagenser som beskrivs i materialförteckningen för att säkerställa en tillförlitlig experimentell design och materialens integritet. För ytterligare tips om hur du planerar ett nytt genomredigeringsexperiment, se artiklar om detta ämne.
   OBS: När de har monterats enligt beskrivningen i de efterföljande stegen kan RNP:er som bereds i förväg lagras vid -80 °C.
   1. Efter att ha valt vilken gen som ska riktas, använd ett av de gratis onlineverktygen för att designa ett optimalt gRNA. Var noga med att rikta in dig på en exon om du hoppas på att generera en knockout.
      OBS: Dessa verktyg hjälper till att identifiera en målplats med en intilliggande S. pyogenes PAM-sekvens, högkvalitativ poäng och låg poäng utanför målet.
   2. Rena S. pyogenes Cas9 proteinet genom publicerade metoder eller köpa det från en kommersiell leverantör.
   3. Förbered en typisk Cas9-buffert för RNA-utspädning, RNP-beredning och proteinlagring, som innehåller 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glycerol och 1 mM TCEP. Använd alltid nukleasfritt vatten i buffertar som ska användas för att återanvända eller späda ut RNA för att förhindra nedbrytning.
   4. Producera guiden RNA (tracrRNA och crRNA eller sgRNA) genom en in vitro-transkription med publicerade metoder, eller köp den från ett nukleinsyrasyntesföretag.
   5. Om du infogar en gen, syntetisera eller köp en donator-DNA-mall.
   6. Förvara proteinet och RNA-alikvoterna vid -80 °C och tina på is omedelbart före användning.
      OBS: Varje frys-tina sänker effektiviteten något. Detaljerade protokoll med öppen åtkomst för Cas9-rening och in vitro-transkription av sgRNAs finns tillgängliga någon annanstans.
2. RNP prep för C. elegansredigering: Montera RNP-komplexet genom att tillsätta följande reagenser för att skapa en slutlig volym på 20 μL (de slutliga koncentrationerna noteras inom parentes): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) och reparationsmallarna vid behov (0,5 μM ssDNA eller upp till 350 ng/μL dsDNA).
   OBS: Effektiviteten hos en Cas9-medierad DSB-mallad reparation står i proportion till koncentrationen av dsDNA-reparationskonstruktionen. Ju högre koncentrationen av reparationsmallen är, desto effektivare blir den mallade reparationen. En injektion av blandningar som innehåller mer än 350 ng/μL dsDNA har dock visat sig minska livskraften hos de injicerade maskarna. Således är det bäst att använda upp till, men inte mer än 350 ng/μL dsDNA i blandningen för att maximera reparationseffektiviteten samtidigt som dess dödlighet minimeras.
   1. Lägg till flera crRNAs för att rikta in dig på flera lokus samtidigt, efter behov för screeningmetoden co-CRISPR/co-conversion. När du lägger till mer än ett crRNA, lägg till varje sekventiellt till huvudmixen.
      OBS: Mängden av varje crRNA behöver inte vara densamma, och även fördubbling av den totala koncentrationen av crRNAs i masterblandningen utan att ändra koncentrationen av Cas9 verkar inte störa frekvensen av mutagenes vid en specifik locus. Exempel beskrivs i detalj i Paix et al.
   2. Blanda genom pipetting och snurra RNP-lösningen vid 16 000 x g i 5 s för att säkerställa att lösningen samlas i botten av röret.
   3. Inkubera lösningen vid 37 °C i 15 m.
   4. Centrifugera provet vid 16 000 x g i 1 minut för att pelleta eventuella partiklar som kan täppa till den tunnborrade mikroinjektionsnålen. Använd supernaten i de efterföljande stegen.
3. C. elegans Förberedelse

1. 1 dag före mikroinjektion: Förbered agaroskuddarna för mikroinjektionen.

1. Gör en 3% (w/v) agarose lösning i vatten genom att tillsätta agarose till vatten och koka lösningen på en kokplatta eller i en mikrovågsugn.
2. Ordna 24 mm x 50 mm x 1,5 mm täckglas glider på ett bord och använd en pastörpipett i glas för att placera en liten (~ 15 μL) droppe agarosalösning på bilden. Platta snabbt till agarosdroppen genom att placera ett annat täckskydd ovanpå. Låt agarosen stelna och ta sedan bort ett av täckglasen.
3. Låt den agarosebelagda täckglaset vara med ansiktet uppåt på en bordsskiva över natten för att torka. Efter 24 timmar, förvara agarosekuddarna i en ren, torr behållare.
   OBS: Dessa kan användas på obestämd tid.

2. Dra i mikroinjektionsnålarna: använd borosilikatglaskapillärer med filament (ytterdiameter 1,0 mm och innerdiameter 0,58 mm), dra nålarna baserat på Mello och Fire⁵⁷ och andra resurser. Nålarna kan användas omedelbart eller lagras i en ren, torr behållare, braced av lerstöd.

3. För underhåll av maskarna, förbered en Nematode Growth Media (NGM) agar hälld i Petri-plattor och upptäckt med OP50-bakterier (för protokoll om standard C. elegans underhåll och recept för tillväxtmedier, se Stiernagle).

4. Stega maskarna för mikroinjektion: 12-24 h före mikroinjektionen, välj L4-iscensatta hermafroditer till en ny NG-agarplatta med OP50-bakterier och inkubera dem över natten vid 20 °C. För varje Cas9 mål/ injektionsblandning, välj ~ 30 maskar till plattan.

4. Dag för mikroinjektion: Ladda den dragna mikroinjektionsnålen med RNP-lösningens supernatant beredd i steg 1.2.
   1. Pipetten från steg 1.2.4 i en dragen kapillärpipett och fyll tillbaka lösningen från kapillärpipetten i den beredda mikroinjektionsnålen (som i allmänhet lastar mindre än 0,1 μL).
5. Montera den laddade nålen på mikroinjektionsapparaten som är fäst vid en mikromanipulator. Ställ in injektionsapparatens tryck på 250 kPa och balanstrycket på 25 kPa.
6. Bryt tillbaka den laddade nålspetsen för att generera en skarp nålkant. Placera ett 15 mm x 15 mm x 1,5 mm fyrkantigt lock på toppen av ett 24 mm x 50 mm x 1,5 mm täckskydd.
   1. Överlägg ena kanten av det fyrkantiga täcket med halokarbonolja 700.
   2. Placera nålen i oljan, vid kanten av det 15 mm fyrkantiga täcket.
   3. Använd en hand för att styra mikroskopsteget och täcket, borsta bilden upp och längs nålens kant samtidigt som du trycker på injektionspedalen/knappen. Bryt tillbaka nålspetsen och öka flödet av vätskan ur nålen. Uppnå ett optimalt flöde genom att få injektionsblandningen att flöda upp längs nålens kant och bilda ~1 bubbla/s.
7. Bekräfta att L4 maskar plockas 12-24 h före microinjection är utvecklingsmässigt iscensatta unga vuxna på dagen för injektion. Välj de unga vuxna maskarna till en NG-agarplatta som saknar OP50-bakterier och låt dem krypa runt i 5 minuter. Detta minskar mängden bakterier som överförs till injektionsdynan, vilket minimerar nålpropparna.
8. Placera en agarose injektionsplatta/täckslip på ett dissekeringsomfång. Använd en maskplockning och lägg ett litet spår av halokarbonolja längs ena kanten av dynan.
9. Använd maskplockningen belagd med olja, lyft flera maskar från NG-agar-plattan och in i oljespåret. Med ett fint hår fäst vid en pipett, till exempel en ögonfrans eller kattvisp, placera maskarna parallellt och tryck försiktigt maskarna i agarosplattan. Tills det är bekvämt med mikroinjektionsproceduren, montera och injicera bara en mask i taget.
   OBS: Den torra agarosen kommer att transportera fukten från maskarna, vilket gör att de klibbar vid dynan. Följaktligen måste man arbeta snabbt eftersom maskarna kan desiccate.
   1. När maskarna är på plats och fästas på dynan, överlägg maskarna med ytterligare några droppar halokarbonolja (~ 20 μL) från maskplockningens spets.
10. C. elegans Gonad Microinjection med RNPs och Vård efter injektion
    Mikroinjektionsprotokollet är anpassat från Mello och Fire och beskrivs i detalj någon annanstans.
    1. Placera täckglaset med de monterade maskarna på injektionsmikroskopet. Placera maskarna vinkelrätt mot injektionsnålen under en låg förstoring (5X-mål, 10X okulär).
       1. Byt till en hög förstoring (40X-mål, 10X okulär), flytta nålen intill gonadarmen som motsvarar regionen nära atomkärnorna i mitten till sent pachyten.
       2. Använd mikromanipulatorn, flytta nålen mot masken och deprimera nagelbandet något. Tryck sedan på sidan av mikroskopsteget med en hand för att skaka nålen genom nagelbandet. Tryck ned injektionspedalen/injektionsknappen och fyll långsamt gonadarmen med injektionsblandningen och ta bort nålen.
       3. Upprepa det här steget med den andra gonadarmen.
    2. När maskarna har injicerats, ta bort täcket / agarose pad och placera den under ett dissekerande mikroskop.
       1. Använd en dragen kapillärpipett och förskjut oljan från maskarna genom att pipettera en M9-buffert över dem. Utför denna behandling för att frigöra maskarna från agaren.
       2. Efter 10 min, när maskarna slår runt i bufferten, flytta dem till en NG-agarplatta med OP50-bakterier med hjälp av den dragna kapillärpipetten. Placera plattan vid 20 °C i 2-3 h tills maskarna har återhämtat sig och rör sig.
    3. När maskarna har återfunnits överför de individuellt till NG-agarplattor med OP50 och överför plattorna till en inkubator på 25 °C.
    4. Låt P_0-injicerademaskar växa och lägga avkomma i 3 dagar. Screena F_1-avkomman.
       1. Om du använder co-CRISPR eller samkonvertering väljer du kandidatmaskarna för screening baserat på om de har den muterade fenotypen av referensgenen. Individuellt överföra dessa märkta maskar till nya NG-agarplattor med OP50 och låt dem lägga F₂ avkomma vid 20 °C.
          OBS: Fenotypen som används för en co-CRISPR screening eller urval bör ge en tidig uppskattning för framgången med Cas9 redigering.
       2. Om co-CRISPR fenotyp inte finns, mikroinject en positiv kontroll plasmid att bidra till att förbättra mikroinjektion effektivitet.
          OBS: Till exempel, inklusive en plasmid i injektionsblandningen som kodar mCherry-märkt MYO-2 hjälper till att bedöma injektionseffektiviteten. Maskar som framgångsrikt injiceras med pCFJ90 kommer att ha några avkommor med fluorescerande särxer.
    5. Undersök F_1-maskarna för närvaron av önskade redigeringar. Välj F_1-modern till en individuell brunn på en 96-brunnsplatta, lysa henne och undersök hennes DNA genom antingen skärspecifik PCR-förstärkning, DNA-sekvensanalys eller surveyorkärnaanalys (CEL-1).
       OBS: Dessa analyser kan utföras när du använder en co-CRISPR/ samkonvertering eller andra screening- eller urvalssystem.

Representative Results

Tabell 1: Positiva kontroller för preliminära genomredigeringsexperiment. Den här tabellen visar den viktigaste informationen som behövs för att utföra ett första gången genomredigeringsexperiment i var och en av de celler och organismer som beskrivs i detta protokoll. Att följa dessa parametrar kommer sannolikt att ge ett framgångsrikt resultat som kan användas för att testa protokollet eller som en baslinje för jämförelse när experimenteraren riktar in sig på en gen av eget intresse. F: framåt, R: omvänd, HDR: homologistyrd reparation. Klicka här om du vill visa en större version av tabellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar