Gonad Microinjection: En metod för sammansatt leverans direkt i germline av C. elegans

Abstract

Källa: Farboud, B. et al, Förbättrad genomredigering med Cas9 Ribonucleoprotein i olika celler och organismer. J. Vis. Exp. (2018). 

Denna video beskriver microinjection, en vanlig metod för att skapa transgena C. elegans stammar.  I exemplet kommer vi att se mikroinjektion som används för att introducera ett ribonukleoproteinkomplex (RNP) komplex för CRISPR-baser genredigering.

Protocol

Följande protokoll är ett utdrag från Farboud et al, Enhanced Genome Editing med Cas9 Ribonucleoprotein i Olika celler och organismer, J. Vis. Exp. (2018). 1. RNP-montering Designa experimentet i god tid och förvärva alla RNA-, DNA- och proteinkomponenter i förväg. Som ett första pass kan du prova en av de positiva kontro…

Representative Results

Tabell 1: Positiva kontroller för preliminära genomredigeringsexperiment. Den här tabellen visar den viktigaste informationen som behövs för att utföra ett första gången genomredigeringsexperiment i var och en av de celler och organismer som beskrivs i detta protokoll. Att följa dessa parametrar kommer sannolikt att ge ett framgångsrikt resultat som kan användas för att testa protokollet eller …

Materials

Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	–	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	–	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	–	–	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	–
9" pasteur pipettes	–
Nuclease-free water	–
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar