Gonad Microinjection: En metode for sammensatt levering direkte inn i Germline av C. elegans

Overview

Denne videoen beskriver mikroinjeksjon, en vanlig metode for å skape transgene C. elegans stammer.  I eksemplet vil vi se mikroinjeksjon som brukes til å introdusere et ribonucleoprotein (RNP) kompleks for CRISPR-baser genredigering.

Protocol

Følgende protokoll er et utdrag fra Farboud et al, Enhanced Genome Editing med Cas9 Ribonucleoprotein i Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018).

1. RNP-montering

1. Design eksperimentet i god tid, og skaff deg alle RNA-, DNA- og proteinkomponentene på forhånd. Som et første pass kan du prøve en av de positive kontrollene som er oppført i tabell 1, og bruke de kommersielle reagensene som er beskrevet i materialtabellen for å sikre en pålitelig eksperimentell design og materialets integritet. Hvis du vil ha flere tips om planlegging av et nytt genomredigeringseksperiment, kan du se artikler om dette emnet.
   MERK: Når de er montert som beskrevet i de påfølgende trinnene, kan RNPer som er klargjort på forhånd, oppbevares ved -80 °C.
   1. Etter å ha valgt hvilket gen du skal målrette mot, bruk et av de gratis online verktøyene for å designe en optimal gRNA. Sørg for å målrette mot en exon hvis du håper å generere en knockout.
      MERK: Disse verktøyene vil bidra til å identifisere et målområde med en tilstøtende S. pyogenes PAM-sekvens, høy kvalitet og lav off-target score.
   2. Rens S. pyogenes Cas9-proteinet gjennom publiserte metoder eller kjøp det fra en kommersiell leverandør.
   3. Forbered en typisk Cas9-buffer for RNA-fortynning, RNP-tilberedning og proteinlagring, som inneholder 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glyserol og 1 mM TCEP. Bruk alltid nukleasefritt vann i buffere som skal brukes til å resuspendere eller fortynne RNA for å forhindre nedbrytning.
   4. Produser guiden RNA (tracrRNA og crRNA eller sgRNA) gjennom en in vitro transkripsjon ved hjelp av publiserte metoder, eller kjøp den fra et nukleinsyresynteseselskap.
   5. Hvis du setter inn et gen, syntetiser eller kjøp en donor DNA-mal.
   6. Oppbevar proteinet og RNA-aliquots ved -80 °C og tine på is umiddelbart før bruk.
      MERK: Hver fryse-tining senker effektiviteten litt. Detaljerte protokoller med åpen tilgang for Cas9-rensing og in vitro-transkripsjon av sgRNAer er tilgjengelig andre steder.
2. RNP forbereder C. elegans redigering: Monter RNP-komplekset ved å legge til følgende reagenser for å skape et endelig volum på 20 μL (de endelige konsentrasjonene er notert i parentes): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM ), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) og reparasjonsmalene om nødvendig (0,5 μM ssDNA eller opptil 350 ng/μL dsDNA).
   MERK: Effektiviteten til en Cas9-mediert DSB-malt reparasjon er proporsjonal med konsentrasjonen av dsDNA-reparasjonskonstruksjonen; Dermed, jo høyere konsentrasjonen av reparasjonsmalen, jo mer effektiv er malreparasjonen. Imidlertid har en injeksjon av blandinger som inneholder mer enn 350 ng / μL dsDNA vist seg å redusere levedyktigheten til de injiserte ormene. Dermed er det best å bruke opptil, men ikke mer enn 350 ng / μL dsDNA i blandingen for å maksimere reparasjonseffektiviteten samtidig som den minimerer dødeligheten.
   1. Legg til flere crRNAer for å målrette flere loci samtidig, etter behov for co-CRISPR / co-conversion screening tilnærming. Når du legger til mer enn én crRNA, legger du til hver sekvensielt i hovedblandingen.
      MERK: Mengden av hver crRNA trenger ikke å være den samme, og selv dobling av den totale konsentrasjonen av crRNAer i mesterblandingen uten å endre konsentrasjonen av Cas9 ser ikke ut til å forstyrre hyppigheten av mutagenese ved et bestemt locus. Eksempler er beskrevet i detalj i Paix et al.
   2. Bland ved pipettering og spinn RNP-oppløsningen på 16.000 x g i 5 s for å sikre at løsningen samles opp nederst på røret.
   3. Inkuber oppløsningen ved 37 °C i 15 m.
   4. Sentrifuger prøven ved 16 000 x g i 1 min for å pellete noen partikler som kan tette den tynnslitte mikroinjeksjonsnålen. Bruk supernatanten i de påfølgende trinnene.
3. C. elegans forberedelse

1. 1 dag før mikroinjeksjon: Forbered agaroseputene til mikroinjeksjonen.

1. Lag en 3% (w / v) agarose løsning i vann ved å legge agarose til vann og bringe løsningen til å koke på en varm plate eller i en mikrobølgeovn.
2. Ordne 24 mm x 50 mm x 1,5 mm dekselglasssklier på et bord og bruk en pasteurpipette i glass for å plassere en liten (~15 μL) dråpe agaroseoppløsning på lysbildet. Flat raskt ut agarosefallet ved å plassere en annen deksleslip på toppen. La agarose å størkne og deretter fjerne en av dekslene.
3. La de agarosebelagte dekslene bli stående med forsiden opp på en bordplate over natten for å tørke. Etter 24 timer, oppbevar agaroseputene i en ren, tørr beholder.
   MERK: Disse kan brukes på ubestemt tid.

2. Trekk mikroinjeksjonsnålene: bruk borosilikatglasskapillærer med filamenter (ytre diameter 1,0 mm og indre diameter 0,58 mm), trekk nålene basert på Mello og Brann⁵⁷ og andre ressurser. Nålene kan brukes umiddelbart eller kan lagres i en ren, tørr beholder, braced av leirestøtter.

3. For vedlikehold av ormene, lag en Nematode Growth Media (NGM) agar helles i Petri-plater og flekket med OP50-bakterier (for protokoller om standard C. elegans vedlikehold og oppskrifter for vekstmedier, se Stiernagle).

4. Stage ormene for mikroinjeksjon: 12-24 h før mikroinjeksjonen, velg L4-iscenesatte hermafroditter til en ny NG-agar plate med OP50 bakterier og inkuber dem over natten ved 20 °C. For hver Cas9 mål/injeksjonsblanding, velg ~30 ormer til platen.

4. Mikroinjeksjonsdag: Lad den trukket mikroinjeksjonsnålen med RNP-oppløsningen supernatant fremstilt i trinn 1.2.
   1. Pipette supernatanten fra trinn 1.2.4 inn i en trukket kapillærpipette og fyll oppløsningen fra kapillærpipetten inn i den tilberedte mikroinjeksjonsnålen (vanligvis lasting mindre enn 0,1 μL).
5. Monter den lastede nålen på mikroinjeksjonsapparatet som er festet til en mikromanipulator. Sett injeksjonsapparattrykket på 250 kPa og balansetrykket til 25 kPa.
6. Bryt tilbake den lastede nålespissen for å generere en skarp nålekant. Plasser en firkantdeksle på 15 mm x 15 mm x 1,5 mm på toppen av et 24 mm x 50 mm x 1,5 mm deksler.
   1. Overlegg en kant av de firkantede dekslene med halokarbonolje 700.
   2. Plasser nålen i oljen, på kanten av den 15 mm firkantede dekslen.
   3. Bruk en hånd til å lede mikroskopstadiet og dekslene, pensle lysbildet opp og langs kanten av nålen mens du trykker på injeksjonspedalen/ knappen. Bryt nålespissen tilbake, og øk strømmen av væsken ut av nålen. Oppnå en optimal strømningshastighet ved å få injeksjonsblandingen til å strømme opp langs kanten av nålen, og danner ~ 1 boble / s.
7. Bekreft at L4 ormer plukket 12-24 timer før mikroinjeksjon er utviklingsmessig iscenesatt unge voksne på injeksjonsdagen. Velg de unge voksne ormene til en NG-agarplate som mangler OP50-bakterier og la dem krype rundt i 5 min. Dette reduserer mengden bakterier som overføres til injeksjonsputen, og minimerer nåleklosser.
8. Plasser en agarose injeksjonspute/deksler på et disseksjonsomfang. Bruk et ormplukk, legg et lite spor av halokarbonolje langs den ene kanten av puten.
9. Bruk ormplukket belagt i olje, løft flere ormer av NG-agarplaten og inn i oljesporet. Med et fint hår festet til en pipette, for eksempel en øyenvippe eller katt whisker, plasser ormene parallelt, skyv forsiktig ormene inn i agaroseputen. Inntil du er komfortabel med mikroinjeksjonsprosedyren, må du bare montere og injisere en orm om gangen.
   MERK: Den tørre agarose vil fukte fra ormene, noe som får dem til å holde seg til puten. Følgelig må man jobbe raskt da ormene kan desiccate.
   1. Når du er på plass og festet til puten, legger du ormene med ytterligere noen få dråper halokarbonolje (~ 20 μL) fra spissen av ormplukkingen.
10. C. elegans Gonad Microinjection med RNPer og post-injeksjon Care
    Mikroinjeksjonsprotokollen er tilpasset fra Mello og Fire og beskrevet i detalj andre steder.
    1. Plasser dekslene med de monterte ormene på injeksjonsmikroskopet. Under en lav forstørrelse (5X objektiv, 10X okulær), plasser ormene vinkelrett på injeksjonsnålen.
       1. Bytt til en høy forstørrelse (40X objektiv, 10X okulær), flytt nålen ved siden av gonadarmen som tilsvarer regionen nær kjernen i midten til sen pachytene.
       2. Bruk mikromanipulatoren til å flytte nålen mot ormen, og trykk neglebåndet litt ned. Deretter, med en hånd, trykk på siden av mikroskopstadiet for å jolte nålen gjennom neglebåndet. Trykk ned injeksjonspedalen/-knappen og fyll langsomt gonadarmen med injeksjonsblandingen og fjern kanylen.
       3. Gjenta dette trinnet med den andre gonadarmen.
    2. Når ormene er injisert, fjern dekslenelip/agaroseputen og legg den under et dissekeringsmikroskop.
       1. Bruk en trukket kapillærpipette til å fortrenge oljen fra ormene ved å pipettere en M9-buffer over dem. Utfør denne behandlingen for å frigjøre ormene fra agaren.
       2. Etter 10 min, når ormene banker rundt i bufferen, flytt dem til en NG-agarplate med OP50-bakterier ved hjelp av den trukket kapillærpipetten. Plasser platen ved 20 °C i 2-3 timer til ormene har kommet seg og beveger seg rundt.
    3. Når de er gjenopprettet, overfør ormene individuelt til NG-agarplater med OP50 og overfør platene til en 25 ° C inkubator.
    4. La P₀-injiserte ormer vokse og legge avkom i 3 dager. Screen F₁ avkom.
       1. Hvis du bruker co-CRISPR eller co-conversion, velger du kandidatormene for screening basert på om de har mutantfenotypen til referansegenet. Overfør disse merkede ormene individuelt til nye NG-agarplater med OP50 og la dem legge F₂ avkom ved 20 °C.
          MERK: Fenotypen som brukes til en co-CRISPR-screening eller -utvelgelse, bør gi et tidlig estimat for suksessen til Cas9-redigering.
       2. Hvis co-CRISPR fenotypen ikke er til stede, mikroinjekt en positiv kontrollplasmid for å hjelpe til med å forbedre mikroinjeksjonseffektiviteten.
          MERK: For eksempel, inkludert en plasmid i injeksjonsblandingen som koder mCherry-merket MYO-2, vil bidra til å vurdere injeksjonseffektiviteten. Ormer som er vellykket injisert med pCFJ90, vil ha noen avkom med fluorescerende svelget.
    5. Undersøk F_1-ormene for å se om de ønskede endringene finnes. Velg F₁ mor til en individuell brønn av en 96-brønns plate, lyse henne, og undersøke hennes DNA ved enten sett inn-spesifikk PCR forsterkning, DNA sekvens analyse, eller landmåler nuclease analyse (CEL-1).
       MERK: Disse analysene kan utføres ved bruk av co-CRISPR/co-conversion eller andre screening- eller seleksjonsregimer.

Representative Results

Tabell 1: Positive kontroller for foreløpige genomredigeringsforsøk. Denne tabellen viser nøkkelinformasjonen som trengs for å utføre et førstegangs genomredigeringseksperiment i hver av cellene og organismene som er beskrevet i denne protokollen. Å følge disse parametrene vil sannsynligvis gi et vellykket resultat som kan brukes til å teste protokollen eller som en basislinje for sammenligning når eksperimentet er rettet mot et gen av egen interesse. F: fremover, R: omvendt, HDR: homologi-rettet reparasjon. Klikk her for å vise en større versjon av denne tabellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar