Gonad Microinjection: En metode for sammensatt levering direkte inn i Germline av C. elegans

Abstract

Kilde: Farboud, B. et al, Forbedret genomredigering med Cas9 Ribonucleoprotein i ulike celler og organismer. J. Vis. Utt. (2018). 

Denne videoen beskriver mikroinjeksjon, en vanlig metode for å skape transgene C. elegans stammer.  I eksemplet vil vi se mikroinjeksjon som brukes til å introdusere et ribonucleoprotein (RNP) kompleks for CRISPR-baser genredigering.

Protocol

Følgende protokoll er et utdrag fra Farboud et al, Enhanced Genome Editing med Cas9 Ribonucleoprotein i Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018). 1. RNP-montering Design eksperimentet i god tid, og skaff deg alle RNA-, DNA- og proteinkomponentene på forhånd. Som et første pass kan du prøve en av de positive kontrolle…

Representative Results

Tabell 1: Positive kontroller for foreløpige genomredigeringsforsøk. Denne tabellen viser nøkkelinformasjonen som trengs for å utføre et førstegangs genomredigeringseksperiment i hver av cellene og organismene som er beskrevet i denne protokollen. Å følge disse parametrene vil sannsynligvis gi et vellykket resultat som kan brukes til å teste protokollen eller som en basislinje for sammenligning n?…

Materials

Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	–	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	–	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	–	–	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	–
9" pasteur pipettes	–
Nuclease-free water	–
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar