Photomotor תגובה Assay: שיטה למדוד את התגובה ההתנהגותית של זברה זברהפיש לשינוי פתאומי במצב תאורה

Overview

סרטון זה מתאר את מבחני התגובה הפוטו-מוטוריים של זברהפיש וזחלי minnow שמנים באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית. הפרוטוקול מודד את התגובה ההתנהגותית של דג הזחל בעקבות שינוי פתאומי במצב התאורה.

Protocol

1. כיול פרמטרים למעקב וידאו

1. לפני אמצעים התנהגותיים, הגדר פרמטרי תצפית וכיול בתוכנת מסלול הווידאו (ראה טבלת חומרים).
   1. מניחים צלחת היטב בתא ההקלטה עם לפחות 1 דג זחל בבאר בודדת. השתמש בצלחת ובדגים המשויכים כייצוגים כדי להגדיר פרמטרי כיול.
   2. בתוכנת רצועת הווידאו, לחץ על "קובץ | צור פרוטוקול", אשר יפתח תיבת דו-שיח "אשף יצירת פרוטוקול". בשדה "ספירת מיקום", הזן את מספר האנשים בארות של צלחת הבאר ולאחר מכן לחץ על "אישור".
   3. בחלק העליון של המסך, לחץ על "הצג | מסך מלא", אשר יבקש מהמערכת להציג תצוגת מצלמה תקורה של צלחת הבאר.
   4. לחץ על הסמל "צייר אזורים", המופיע כשלוש צורות צבעוניות. מימין לאזור התצוגה של לוח הבאר, בחר בסמל העיגול בשדה שכותרתו "אזורים".
   5. השתמש בסמן כדי לסמן את אזור מעקב הווידאו המעגלי בחלק השמאלי העליון של הצלחת היטב. בחר באפשרות "סימון ימני עליון" ולאחר מכן תאר היטב את אזור התצוגה של החלק הימני העליון. לאחר מכן, בחר "סימון תחתון" כדי לחלק את החלק הימני התחתון היטב.
      הערה: לאחר ציור החלוקה לרמות המעגלית, סביר להניח שיהיה צורך להתאים את מיקומו.  כדי להתאים את מיקום החלוקה לרמות, לחץ על "בחר" ולאחר מכן השתמש בסמן כדי להזיז את האזור המחולק לרמות. כמו כן, ניתן לשכפל קווי מתאר על-ידי לחיצה על "העתק" ולאחר מכן "הדבק".
   6. לאחר שהוגדרו אזורי המעקב השמאליים, הימניים העליונים והתחתונים, לחץ על "בנה" כדי לבקש מהתוכנה לתווה באופן אוטומטי את אזורי הצפייה של הבארות הנותרות.
   7. באזור שכותרתו "כיול", לחץ על "צייר קנה מידה". השתמש בסמן כדי לצייר קו אופקי לאורך הלוח. לאחר שציירו את הקו, תופיע תיבת דו-שיח שכותרתה "מדידת כיול". הזן את אורך הצלחת היטב ולחץ על "אישור".
   8. צא ממנהל הציור על-ידי לחיצה על הסמל "צייר אזורים".
   9. לחץ על הסמל "אריחים".  באמצעות הסמן, סמן את כל התיבות המופיעות במסך התצוגה כך שכל תיבה תירוק בירוק.
      הערה: סמל האריחים מופיע כקבוצה של שישה ריבועים קטנים בודדים
   10. "לחץ על תצוגה| מסך מלא".  משמאל לאזור הצפייה בלוח, לחץ על "Bkg" בתיבה שכותרתה "סף זיהוי". השתמש בסרגל התאמת הסף כדי לקבוע את סף זיהוי הפיקסלים. לאחר שנבחר סף זיהוי הפיקסלים המתאים, לחץ על "החל על הקבוצה".
       הערה: פרוטוקול זה מגדיר את סף הזיהוי על 13 במצב שחור עבור תצפיות זברה-דג וב 110 במצב שקוף עבור תצפיות minnow fathead.
   11. בתיבה שכותרתה "סף תנועה", הזן את הפרמטרים הרצויים למעקב אחר מהירות התנועה. לאחר הגדרת פרמטרי המהירות, לחץ על "החל על קבוצה".
       הערה: פרוטוקול זה מגדיר תנועות קטנות/גדולות במהירות של 20 מ"מ/ים ותנועות לא פעילות/קטנות במהירות של 5 מ"מ/ים. בחירות אלה לתכנת את התוכנה כדי לעקוב אחר תנועת דגי הזחל בשלוש רמות מהירות שונות: לא פעיל (הקפאה) = <5 מ"מ / s, קטן (שיוט) = 5-20 מ"מ / s, גדול (מתפוצץ) = >20 מ"מ / s.
   12. לחץ על "פרמטרים | פרמטרי פרוטוקול" מהתפריט הנפתח. בתיבת הדו-שיח , בחר בכרטיסיה "שעה". הזן את זמן התצפית ואת זמן האינטגרציה. לאחר הזנת הפרמטרים, לחץ על "אישור".
   13. כדי להגדיר את זמני הצילום הבהיר/כהה ואת עוצמת האור עבור כל פוטופריוד, פתח את תיבת הדו-שיח של הגדרות מנהל ההתקן הבהיר על-ידי בחירה באפשרות "נהיגה קלה" מהתפריט הנפתח "פרמטרים".
       הערה: ראה וידאו פרוטוקול להגדרת פוטופריודים כהים בהירים מרובים.
   14. לאחר הגדרת הפרמטרים למעקב וידאו, שמור את פרוטוקול התצפית.
       הערה: פרוטוקול זה מתבונן בהתנהגות הדגים לאורך תקופה של 50 דקות הכוללת שלב התאקלמות של 10 דקות ואחריו 4 שלבים בהירים/כהים משתנים המורכבים משתי תקופות אור של 10 דקות ושתי תקופות כהות של 10 דקות. זמן האינטגרציה מוגדר למדידת התנהגות עבור כל דקה של 50 דקות ניסיון התנהגותי.

2. תצפית על זחל דגים לוקומוטור והתנהגות פוטומוטורית

1. מניחים את צלחת הבאר המכילה דגים ניסיוניים בתא ההקלטה ההתנהגותי.
2. בתוכנת מעקב הווידאו, פתח את פרוטוקול המעקב שפותח בשלב הבא.
3. במציג מעקב הווידאו, בדוק כדי לוודא שכל הזחלים גלויים על מסך המחשב, שרק זחל בודד אחד קיים בכל באר, וכי בארות בודדות מיושרות בתוך אזורי התצפית שהוגדרו בשלבים 1.1.5 ו- 1.1.6.
4. לחץ על "התנסה | בצע".
   הערה: המערכת תבקש מהמשתמש לספק שם ומיקום לשמירת נתוני התצפית.
5. לאחר שצוינו השם ומיקום השמירה של נתוני התצפית, לחץ על סמל "מספר תמונות חיות" כדי לסמן את כל אזורי התצוגה המוגדרים מראש
   הערה: סמל זה ממוקם בחלק העליון של מסך המחשב ומופיע כתיבה המחולקת לארבעה ריבועים קטנים יותר. לחיצה על סמל זה תסמן את כל אזורי התצוגה המוגדרים מראש.
6. סגור את החלונית של תא ההקלטה ולחץ על "רקע | הפעל" בצג המחשב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers