Summary

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Published: November 20, 2010
doi:

Summary

Este protocolo de vídeo se muestra el método de ensayo neuroesfera para generar y expandir las células madre neurales de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurarse de que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible.

Abstract

El aislamiento y la expansión de las células madre neurales putativo (NSC) del cerebro murino adulto fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss en 1992, empleando una química definida libre de suero sistema de cultivo conocido como ensayo neuroesfera (NSA). En este ensayo, la mayoría de los tipos de células diferenciadas mueren a los pocos días de la cultura, sino una pequeña población de células precursoras del factor de crecimiento de respuesta experimentan una proliferación activa en presencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y / factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Estas células forman colonias de células indiferenciadas llamadas neuroesferas, que a su vez puede ser un subcultivo para ampliar el grupo de células madre neurales. Por otra parte, las células pueden ser inducidas a diferenciarse, generar los tres tipos principales de células de las neuronas del SNC, es decir, astrocitos y oligodendrocitos. Este ensayo proporciona una valiosa herramienta para proporcionar una fuente constante y renovable de los precursores del SNC no diferenciadas, que podrían ser utilizados para estudios in vitro y también con fines terapéuticos.

Este video muestra el método NSA para generar y ampliar NSCs de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurar que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la extracción del cerebro del ratón adulto, micro-disección de la región periventricular, la preparación del tejido y la cultura de la NSA. El tejido es la primera cosecha químicamente digerido con tripsina-EDTA y luego disociado mecánicamente en un medio de NSC para lograr una suspensión de células individuales y, finalmente, se sembraron en la NSA. Después de 7-10 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes están listos para la subcultura de llegar a la cantidad de celdas requeridas para futuros experimentos.

Protocol

<p class="jove_title"> Parte 1: Configuración básica antes de proceder a la disección:</p><ol><li> Volumen apropiado de medio completo NSC se prepara mezclando NeuroCult NSC medio basal y NeuroCult Suplementos NSC proliferación en una proporción de 9:1, respectivamente. Medio NSC también se pueden hacer en el laboratorio basado en la composición NSC medio de crecimiento publicados en la literatura<sup> 1</sup>. Si su laboratorio no tiene mucha experiencia con la fabricación de medio, se recomienda utilizar medio dispon…

Discussion

El ensayo neuroesfera 2 ha ganado gran atención en la comunidad de investigación no sólo para el aislamiento y estudio de los comités directivos de la CNS 05/04, sino también para el aislamiento de otros tipos de células madre putativa de numerosos tejidos, como el de mama 6 y 7 y el corazón para la identificación de cerebro, mama y colon células madre tumorales 8-9 lo que sugiere que este sistema de cultivo se puede aplicar a una serie de síntomas somáti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700  
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701  
%0.05 trypsin-EDTA Reagent Gibco 25300-062  
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma T6522  
Cell strainer Sieve BD Falcon 352340  
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196  
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905  
EGF Growth factor R&D 2028-EG  
Pen/Strep Reagent Gibco 15140-122  
*MEM Reagent Gibco 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma H4034 HEM component
*Distilled water Reagent Gibco 15230-147  
15 ml tubes Culture ware BD Falcon 352096  
50 ml tubes Culture ware BD Falcon 352070  
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35  
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30  
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10  
b-FGF Growth factor R&D 3139-FB  
Heparin Growth factor Sigma H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

References

  1. Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
  4. Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
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  8. Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
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  10. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  11. Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).

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Cite This Article
Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393, doi:10.3791/2393 (2010).

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