Summary
عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من عدم التجانس الخلوية من الدماغ ضروري للتحقيق في دورها في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية. هذا البروتوكول يصف العزلة الميكانيكية والمختلطة تقنية زراعة الخلايا التي توفر عائدات عالية ونقاء عالية، وقابلة للحياة خلايا دبقية صغيرة الرئيسي لل
Protocol
1. تشريح من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ
- البرد ليبوفيتز لL-15 وسائل الإعلام مكيفة (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ BSA + 1٪ القلم / بكتيريا) إلى 4 درجة مئوية. وسائل الإعلام ثقافة الدافئة (DMEM + 10٪ + 1٪ FBS البنسلين / الستربتومايسين عقار) إلى 37 درجة مئوية. إعداد 4 60x15 ملم أطباق بتري مع مل 4-5 من وسائل الإعلام L-15 مكيفة على الجليد. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول بنسبة 100٪.
- شطف P2 الجراء الراب الوليد مع الايثانول 70٪. (ويمكن استخدام الفئران الوليدة حديثي الولادة الذين تتراوح أعمارهم بين P1-P5 في هذا البروتوكول.)
- قطع رأس بسرعة فأر الجرو مع مقص حاد عقيم وإسقاط رئيس فورا إلى إيثانول 70٪. تكرار لما مجموعه الفئران الوليدة 5 ثم نقل إلى رؤساء محلول ملحي.
- إزالة دماغ كامل من رؤساء ومكان في طبق بيتري مع 4-5 مل L-15 حل (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ BSA + 1٪ القلم / بكتيريا) على الجليد.
- كرر الإجراءات 1،2-1،4 لالجراء المتبقية في القمامة.
- إزالة السحايا من الدماغ ونقل قصرired أنسجة المخ (أي القشرة، المخيخ والمخ كله، وما إلى ذلك) في طبق بيتري جديد مع مل 4-5 من حل-15 L (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ BSA + 1٪ القلم / بكتيريا) على الجليد.
2. إعداد المختلطة السكان الخلايا الغروية
- بدون نسيج الدماغ مع مقص أو شفرة 1، نقل الأنسجة مع ماصة 10 مل إلى 50 مل أنبوب معقم مخروطي.
- منبذة المخروطية في 2500 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح طاف. إضافة مل 4-5 من وسائل الإعلام L-15 الطازجة (ليبوفيتز L-15 + 0.1٪ + 1٪ BSA القلم / بكتيريا).
- ماصة النسيج صعودا ونزولا 10 مرات مع ماصة معقمة 10 مل.
- وضع مصفاة الخلية (مسام ميكرون 100) على أنبوب جديد 50 مل مخروطي. ماصة النسيج صعودا وهبوطا مرة واحدة مع ماصة معقمة و 5 مل مع ماصة مطاردة لمصفاة الخلية، والاستغناء عن المواد من خلال مصفاة الخلية في أنبوب مخروطي الشكل.
- شطف مصفاة مع خلية 4-5 مل من وسائل الإعلام L-15 الطازجة (ليبوفيتز L-15 + BS 0.1٪قلم + 1٪ / بكتيريا).
- منبذة مخروطي مع خلايا توتر في 2500 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
3. طلاء وصيانة مختلط زراعات الخلايا الغروية
- لكل دماغ الفئران الجرو معالجتها، وإعداد 1 T-75 قارورة معقمة وذلك بإضافة 12 مل من وسائل الإعلام ثقافة (DMEM + 10٪ + 1٪ FBS البنسلين / الستربتومايسين عقار) في كل قارورة.
- نضح طاف من الخلايا مكعبات وإضافة 5-6 مل من وسائل الإعلام ثقافة لبيليه الخلية. ماصة صعودا ونزولا 10 مرات مع ماصة 10 مل.
- نقل حجم مساو من التعليق على كل قارورة خلية T-75.
- احتضان القوارير في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 5٪ عند 37 درجة مئوية ليصبح المجموع 1-3 أسابيع.
- وينبغي أن قوارير حضنت 1 لمدة 5 أيام، و في اليوم الخامس، تحل محل وسائل الإعلام في ثقافة كل قارورة مع 12 مل من وسائل الإعلام الجديدة والعودة إلى الحاضنة. ثم، كل 3 أيام، تحل محل وسائل الإعلام مكيفة في كل قارورة مع 12 مل من وسائل الإعلام الجديدة لتحقيق التقاء. يجب أن يكون هذا فعلشمال شرق بعناية فائقة دون لمس الجزء السفلي من القوارير حيث الخلايا تعلق.
4. العزلة والتصفيحات من الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية
- بعد الثقافات الدبقية المختلطة هي متكدسة تماما، وإزالة قوارير من الحاضنة وتغطية مباراة دولية مع قارورة parafilm لمنع تبادل الغازات مع الهواء البيئية.
- هز قوارير في 100 RPS (معمل رفيق SI-600، Jeio تك) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
- جمع وسائل الاعلام من كل قوارير مع ماصة 10 مل دون تعطيل طبقة نجمية على سطح القارورة. وضع وسائل الإعلام في أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة وسائط جديدة للقوارير ودوارق العودة إلى الحاضنة.
- منبذة أنابيب مخروطية الشكل في 2500 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح طاف من جميع الأنابيب المخروطية. الكريات الخلية مرتفعة الخلايا الدبقية الصغيرة نقاء. Resuspend الكريات في 1 مل من الخلايا الدبقية الصغيرة الطلاء وسائل الاعلام (FES DMEM + 10٪ + 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عقار).
- حساب كثافة خلية في وسائل الإعلام باستخدام معلق1 عدادة الكريات.
- إضافة حجم مناسب من وسائل الإعلام تصفيح الخلايا الدبقية الصغيرة لتحقيق 2 × 10e5 الخلايا في كثافة مل. لوحة بالشكل المناسب لتحليل تجريبي.
- تسمح الخلايا الدبقية الصغيرة لنعلق بين عشية وضحاها.
5. ممثل النتائج
وصف بروتوكول أعلى نتائج في الثقافات نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية عالية. على النحو الذي يحدده المناعية لخلايا البلاعم علامة / الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة (Iba1)، مطلي الثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة هي> نقي بنسبة 90٪ (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، وتلطيخ لعلامات خلية نجمية، oligodendrocyte والخلايا العصبية محدد يوضح الحد الأدنى من التلوث (الشكل 2). بعد تأسيس مختلط الثقافات الخلية الدبقية، يمكن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة التي تهز تصل إلى 4 مرات متتالية. وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية تعطي ما يقرب من 2.2 X 106 خلية / مل أو حوالي 9 ملايين الخلايا لكل 10 قوارير والعائد المتوقع يتناقص مع كل شاء المتعاقبةكه. وقد استخدمت الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بواسطة هذه الطريقة بنجاح لتحقيق القدرة البلعمة، وظيفة مثل انتاج اكسيد النتريك، والسمية العصبية (الشكل 3) 13-14.
الشكل 1. نظرة عامة على بروتوكول لإعداد مختلط الثقافات الخلية الدبقية وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية.
الشكل 2. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عالية النقاء النحو الذي تتحقق منه تحليل المناعى باستخدام الخلايا الدبقية الصغيرة (إيبا-1، الحمراء)، نجمية (GFAP والأخضر)، الخلايا العصبية (NeuN، أحمر) وoligodendrocyte (CC1، أحمر) بعلامات محددة. ويظهر أيضا لتلطيخ الحمض النووي للخلايا في ثقافة بواسطة دابي (الأزرق).
الشكل 3. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة في طريقة descriوقد استخدمت سرير في عدد من الفحوص، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، فحوصات البلعمة، المقايسات وظيفة والدراسات العصبية. في هذه الدراسات، وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة (إيبا-1 إيجابي، والأخضر)، عند تعرضها للسيطرة على (A) أو LPS (B) وسائل الاعلام المعالجة، وزيادة البلعمة بهم من الخرز اللاتكس fluorescently المسمى (الحمراء)، التي يمكن قياسها كميا ( C). كذلك، يمكن أن LPS (1ng/ml) علاج زيادة انتاج اكسيد النيتريك في الخلايا الدبقية الصغيرة (D). أخيرا، عبر كل من transwell إدخالها وفصل أو مباشرة الثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة، الخلايا العصبية، فقد وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة حضنت مع LPS يمكن أن تحفز الخلايا العصبية موت الخلايا التي تقاس الديهيدروجينيز اللاكتات (LDH) اطلاق سراح (E، F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين يستخدم بصورة روتينية على هذا البروتوكول لإنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة نقية وصحية للتجارب البحثية، وإمعان النظر في الجوانب الفنية خلال المراحل الحاسمة من الإجراء الحد من التقلبات في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. الأول، أثناء تشريح أنسجة الدماغ من الفئران الوليدة حديثي الولادة، والعمل في الوقت المناسب أمر ضروري للحد من الأضرار الدماغية ونقص الأوكسجين للأنسجة. ومع ذلك، فمن المهم أيضا أن إزالة الغطاء سحائي من الدماغ خلال تشريح، لأن وجود السحايا سوف يسهم في تلوث الليفية كبيرة نظرا لمعدل الانتشار السريع في ظل هذه الظروف الثقافة.
الثانية، والمناولة لطيف من المواد الأنسجة أثناء التحضير لزراعة الخلايا الدبقية المختلطة المهم أيضا للحد من تلف الخلايا، والموت، أو تفعيل دبقية صغيرة المفرطة. عند إضافة وسائل الإعلام ثقافة، ينبغي الحرص على عدم الإضرار اثنين نجميةolayer. بالإضافة إلى ذلك، في حين تهز قوارير لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، وضبط وتيرة اهتزاز تكون ضرورية لمنع الخوض أو تشكيل فقاعات الهواء في وسائل الإعلام. قد تكون هذه الأحداث تزيد من تلوث نجمية أو تسبب تلف الخلايا على ثقافات. عند وضع هذه التقنية في المختبر، قد يكون من الضروري أن تبدأ مع اهتزاز قوة البدنية منخفضة (على سبيل المثال 100 دورة في الدقيقة)، ومراقبة خلية ثقافة وطاف بواسطة المجهر قبل زيادة قوة الهز ومدة الحصول على العائد المطلوب من الخلايا الدبقية الصغيرة من دون تلوث نجمية.
ينبغي الحفاظ على اعتبار آخر خلال الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول في المختبر وتحديد مدة الوقت مختلط الثقافات الخلية الدبقية قبل عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للطلاء. بينما العزلة الأولية يمكن أن تحدث من 1 إلى 3 أسابيع بعد تأسيس ثقافة، فإن confluency من الخلايا الدبقية الصغيرة على أحادي الطبقة نجمية تختلف وربما فيعلم الأحياء فلوينس دبقية صغيرة في التجارب اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك، قد العزلة لاحق من نفس المختلط ثقافة الخلية الدبقية بحاجة إلى أن تستند إلى confluency للثقافة بالمقارنة مع المدة المحددة بين الإجراءات اهتزاز. علاوة على ذلك، منذ العائد من الانخفاضات العزلة اللاحقة، من المهم أن نلاحظ الخصائص الخلوية من الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية قد تكون مختلفة عن الأولى لعزلة الماضي. وبالتالي، ينبغي إجراء التجارب الفنية في يتطابق مع تدوين دقيق عندما يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة.
أخيرا، في حين يمكن أن يناقش هذا البروتوكول العزلة دبقية صغيرة من أدمغة الفئران الجرو، والعزلة من الخلايا الدبقية الصغيرة الناجحة أيضا يمكن تحقيقه باستخدام الفئران وغيرها من الأنسجة العصبية، مثل النخاع الشوكي. أي تغير ملموس في البروتوكول هو ضروري لهذه المصادر البديلة الخلايا الدبقية الصغيرة، وراء زيادة حصة تصفيح الأولية للثقافات مختلطة (أي 2 الماوس brains/T75 قارورة أو شارك في العمود الفقري 3-4RDS من قارورة P2 pups/T75 فأر). وبالإضافة إلى ذلك، كما هو متوقع، والغلة الخلية يميل إلى تقليل وفقا للمادة مخفضة بدءا. لكن، على الرغم من الحصول على انخفاض العوائد من استخدام الفأرة أنسجة المخ، واحد الميزة الرئيسية هي أن تكون قادرة على التحقيق في الآليات الجزيئية لعلم وظائف الأعضاء والخلايا الدبقية الصغيرة التفاعل باستخدام أنسجة الدماغ من الفئران المعدلة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بتمويل من برنامج جماعية في جامعة الخدمات النظامية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
