Summary
Isolering primära mikroglia från cellulära heterogenitet i hjärnan är viktigt att undersöka deras roll i både fysiologiska och patologiska tillstånd. Detta protokoll beskriver en mekanisk isolering och blandad cellkultur teknik som ger högt utbyte och hög renhet, viabla primära mikrogliaceller för
Abstract
Mikroglia i cirka 12% av det totala cellulära populationen i däggdjurshjärnan. Medan nervceller och astrocyter anses de viktigaste celltyperna i nervsystemet, mikroglia spelar en viktig roll i normal hjärna fysiologi genom att övervaka vävnad för skräp och patogener och bibehålla homeostas i parenkymet via fagocytiska aktiviteten 1,2. Mikroglia aktiveras under ett antal skador och sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar, traumatisk hjärnskada, och nervsystemet infektion 3. Under dessa aktiverande förhållanden, mikroglia öka deras fagocytisk aktivitet genomgår morpohological och proliferativ förändring, och aktivt utsöndrar reaktivt syre och arter kväve, pro-inflammatoriska kemokiner och cytokiner, ofta aktivera ett parakrin eller autokrin loop 4-6. Eftersom dessa mikrogliaceller svar bidrar till sjukdom patogenes vid neurologiska tillstånd, fokuserad forskning på microglia är motiverad.
På grund av den cellulära heterogenitet i hjärnan, är det tekniskt svårt att erhålla tillräcklig microglial provmaterialet med hög renhet under in vivo-experiment. Aktuell forskning om neuroprotektiva och neurotoxiska funktioner mikroglia kräver en rutin teknisk metod att konsekvent skapa ren och hälsosam mikroglia med tillräcklig avkastning för studien. Vi presenterar, i text och video, ett protokoll för att isolera rena primära mikroglia från blandade glia kulturer för olika tillämpningar i efterföljande led. I korthet använder denna teknik skiljas hjärnvävnad från nyfödda råttungar att producera blandade gliala cellodlingar. Efter att de blandade gliala kulturerna når sammanflytning primära mikroglia mekaniskt isolerad från den kultur av en kort varaktighet skakning. De mikroglia stryks sedan vid hög renhet för experimentella studier.
Principen och protokollet för denna metod harbeskrivits i litteraturen 7,8. Dessutom är alternativa metoder för att isolera primära mikroglia väl beskriven 9-12. Homogeniserad hjärnvävnad kan separeras genom densitetsgradientcentrifugering för erhållande primära mikroglia 12. Emellertid är det centrifugering av måttlig längd (45 min) och kan orsaka cellulär skada och aktivering, samt, orsakar anrikad mikroglia och andra cellpopulationer. Annat protokoll har använts för att isolera primära mikroglia i en mängd organismer vid långvarig (16 h) skakning medan i kultur 9-11. Efter skakning, är mediet supernatanten centrifugerades för att isolera mikroglia. Denna längre två steg isolering metoden kan också störa microglial funktion och aktivering. Vi använder främst följande mikroglia isoleringen protokollet i vårt laboratorium för ett antal skäl: (1) primärt mikroglia simulerar in vivo biologi mer troget än odödliga gnagare mikroglia cellinjer, (2) Nominellt mekanisk störning minimerar potentiella cellulär dysfunktion eller aktivering, och (3) tillräcklig avkastning kan erhållas utan passage av de blandade gliaceller kulturer.
Det är viktigt att notera att detta protokoll använder hjärnvävnad från nyfödda råttungar att isolera mikroglia och att använda äldre råttor för att isolera mikroglia avsevärt kan påverka avkastningen, aktivering status och funktionella egenskaper isolerad mikroglia. Det finns belägg för att äldre är kopplad till mikroglia dysfunktion, ökad neuroinflammation och neurodegenerativa sjukdomar har så tidigare studier användes ex vivo vuxna mikroglia att bättre förstå vilken roll mikroglia vid neurodegenerativa sjukdomar där åldrandet är viktig parameter. Däremot kan ex vivo mikroglia inte hållas i odling under längre tidsperioder. Därför, medan detta protokoll förlänger livslängden på primära mikroglia i kultur, bör det noteras att mikroglia beter sig differently från vuxen mikroglia och in vitro-studier bör noga övervägas vid omräkning till en in vivo miljö.
Protocol
1. Dissektion av neonatal råtta hjärnvävnad
- Chill Leibovitz L-15 konditionerat medium (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) till 4 ° C. Varma odlingsmedia (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin) till 37 ° C. Framställ 4 60x15 mm Petriskålar med 4-5 ml av det konditionerade L-15 medium på is. Sterilisera alla kirurgiska verktyg med 100% etanol.
- Skölj P2 neonatala rap valpar med 70% etanol. (Neonatala råttungar som är mellan P1-P5 kan användas i detta protokoll.)
- Snabbt halshugga en råtta valp med sterila vass sax och släppa huvudet omedelbart till 70% etanol. Upprepa för totalt 5 råttungar överför sedan huvudet i saltlösning.
- Avlägsna de hela hjärnorna från huvudena och placera i en Petri-skål med 4 - 5 ml L-15 lösning (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) på is.
- Upprepa förfaranden 1.2 - 1.4 för de återstående valparna i kullen.
- Avlägsna meningerna från hjärnan och överföra den desIRED hjärnvävnad (dvs., cortex, cerebellum, hel hjärna, etc.) till en ny petriskål med 4-5 ml av L-15 lösning (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) på is.
2. Framställning av blandad gliacell Population
- Utan att skada hjärnvävnad med sax eller en kniv, överför vävnaden med en 10 ml pipett till en steril 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera konisk vid 2500 RCF i 5 min vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten. Tillsätt 4-5 ml färskt L-15 medium (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Pipettera vävnad upp och ner 10 gånger med en steril 10 ml pipett.
- Placera en cellfilter (100 fim porer) på en färsk 50 ml koniskt rör. Pipett vävnad upp och ned en gång med en steril 5 ml pipett och med pipett i nivå med cellfilter och dispensera materialet genom cellen sil in i koniska rör.
- Skölj cellfilter med 4-5 ml av färska L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Centrifugera konisk med spända celler vid 2500 RCF i 5 min vid 4 ° C.
3. Plätering och underhåll av blandade gliaceller kulturer
- För varje råttunge hjärna bearbetas, framställa 1 sterila T-75 kolv genom tillsats av 12 ml av kulturen medium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin) till varje kolv.
- Sug av supematanten från de pelleterade cellerna och tillsätt 5-6 ml odlingsmedium till cellpelleten. Pipettera upp och ner 10 gånger med en 10 ml pipett.
- Överföra en lika stor volym av cellsuspension till varje T-75 kolv.
- Inkubera kolvar i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C under totalt 1-3 veckor.
- Kolvarna bör först inkuberas i 5 dagar, och på den femte dagen, ersätta odlingsmediet i var och en kolv med 12 ml färskt medium och återgå till inkubatorn. Därefter, var 3 dagar, ersätta det konditionerade mediet i varje kolv med 12 ml av färskt medium för att uppnå konfluens. Detta måste görane försiktigt mycket utan att röra botten av kolvarna där cellerna fäster.
4. Isolering och Plätering av primär Mikroglia
- Efter blandade gliala kulturer är helt sammanflytande, ta bort kolvar från inkubatorn och täck kolvens kapsyler med parafilm för att förhindra gas utbyte med omgivande luft.
- Skakkolvar vid 100 varv per sekund (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) under 1 h vid 37 ° C.
- Samla media från alla flaskor med en 10 ml pipett utan att störa astrocyt skiktet på kolven ytan. Placera materialet i 50 ml koniska rör. Tillsätta färsk media till kolvarna och kolvar återvändande till inkubatorn.
- Centrifugera koniska rör vid 2500 RCF i 5 min vid 4 ° C.
- Sug supernatant från alla koniska rör. Cellpelletar är hög renhet mikroglia celler. Återsuspendera pelleten i 1 ml av mikroglia plätering medium (DMEM + 10% FES + 1% penicillin / streptomycin).
- Räkna celltätheten i de återsuspenderade media med hjälpen hemocytometer.
- Lägg till en lämplig volym av mikroglia plätering media för att uppnå en 2 x 10E5 celler per ml densitet. Plattan som är lämpligt för experimentell analys.
- Tillåta mikroglia fästa över natten.
5. Representativa resultat
Det protokoll som beskrivits ovan resulterar i hög renhet primära mikroglia kulturer. Enligt bestämning med immunhistokemi för en makrofag / mikroglia cellspecifik markör (Iba1), pläterade mikroglia kulturer är> 90% ren (figur 2). Dessutom färgning av astrocyt, oligodendrocytceller och neuron cell specifika markörer visar minimal förorening (Figur 2). Efter upprättandet blandade gliaceller cellodlingar kan mikroglia isoleras genom att skaka upp till 4 på varandra följande gånger. Den ursprungliga mikroglia isoleringen kommer att ge ca 2,2 x 106 celler / ml eller cirka 9 miljoner celler per 10 flaskor och den förväntade avkastningen minskar med varje successiv shake. Mikroglia isolerades genom denna metod har använts med framgång för att undersöka förmågan fagocytos, funktion, såsom kväveoxid, och neuronal toxicitet (figur 3) 13-14.
Figur 1. Översikt av protokollet för framställning av blandade gliaceller cellkulturer och isolering av primär mikroglia.
Figur 2. Isolering av hög renhet mikroglia, vilket verifierats genom immunhistokemisk analys med hjälp av mikroglia (Iba-1, röd), astrocyt (GFAP, grön), neuron (Neun, röd) och oligodendrocyt (CC1, röd) specifika markörer. Färgning för DNA av celler i odling genom DAPI (blått) visas också.
Figur 3. Mikroglia isoleras i metoden describädd har använts i ett antal analyser, inklusive, men inte begränsat till, fagocytos analyser, funktion och studier neurotoxicitet. I dessa studier har vi funnit att mikroglia (Iba-1-positiv, grön), när den utsätts för kontroll (A) eller LPS (B) behandlat medium, ökar sin fagocytos av fluorescensmärkta latexkulor (röd), som kan kvantifieras ( C). Vidare kan LPS (1ng/ml) behandling ökar produktionen av kväveoxid i mikroglia (D). Slutligen, både via transwell insats separerade-eller direkta mikroglia-neuron kulturer har vi funnit att mikroglia inkuberas med LPS kan inducera neuronal celldöd mätt med laktatdehydrogenas (LDH) frisättning (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även detta protokoll rutinmässigt används för att producera ren och hälsosam mikroglia för forskning experiment kommer noggrant övervägande av de tekniska aspekterna vid kritiska delar av förfarandet minimera variabiliteten i den isolerade mikroglia. Första, under dissektionen av hjärnvävnad från neonatala råttungar, som arbetar i tid är nödvändig för att minimera hypoxisk och ischemisk skada på vävnaden. Men det är också viktigt att helt ta bort meningeal täckningen från hjärnan under dissektionen, eftersom närvaron av hjärnhinnor kommer att bidra till betydande fibroblast förorening på grund av deras snabba spridningen takt under dessa odlingsbetingelser.
För det andra, skonsam hantering av vävnaden materialet under beredningen av den blandade gliaceller kultur är också viktigt att begränsa cellskador, död eller överdriven microglial aktivering. När du lägger till kultur media, bör försiktighet iakttas för att inte skada astrocyt månolayer. Dessutom kan under omskakning kolvarna för mikroglia isolering, justera frekvensen att skaka bli nödvändig för att förhindra slussning eller bildandet av luftbubblor i media. Dessa händelser kan öka astrocyt förorening eller orsaka cellskador till odlingarna. När man utvecklar denna teknik i laboratoriet, kan det vara nödvändigt att starta med låg hållfasthet fysiska skakning (t ex 100 rpm) och observera cellodling och supernatanten genom mikroskopi för att sedan öka skaka kraft och långvarig för att ge en önskad avkastning av mikroglia utan astrocyt förorening.
En annan faktor under optimeringen av detta protokoll i laboratoriet är att bestämma hur lång tid blandade gliaceller cellkulturer bör bibehållas innan isolera primära mikroglia för plätering. Även ursprungliga isoleringen kan ske från 1 till 3 veckor efter odling etablering kommer sammanflytning av mikroglia på astrocyt monolagret skiljer sig åt och kan iinflytande microglial biologi i senare led experiment. Dessutom kan efterföljande isoleringar från samma blandade gliaceller cellodling måste baseras på sammanflöde av kulturen jämfört med en angiven tid mellan skakar förfaranden. Vidare, eftersom utbytet från efterföljande isolering minskar, är det viktigt att notera de cellulära egenskaperna hos den primära mikroglia kan skilja sig från första till sista isolering. Därför bör försök göras i tekniska replikerar med noggrann notering om när mikroglia är isolerade.
Slutligen kan samtidigt detta protokoll diskuterar microglial isolering från råtta valp hjärnor, framgångsrik isolering av mikroglia också uppnås med hjälp möss och andra nervvävnad, såsom ryggmärg. Ingen signifikant förändring av protokollet är nödvändig för dessa alternativa mikroglia källor utanför att den ursprungliga pläteringen ransonen för blandade kulturer (dvs. 2 mus brains/T75 kolv eller 3-4 spinal samarbeteRDS från P2 råtta pups/T75 kolv). Dessutom, som skulle förväntas, tenderar cellutbyte att minska i enlighet med det reducerade utgångsmaterial. Trots att få lägre avkastning från att använda vävnad musen hjärnan, är en stor fördel att kunna undersöka molekylära mekanismer av mikroglia fysiologi och reaktivitet med hjärnvävnad från transgena möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansieras av intramural programmet vid uniformerade Services universitetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
