Summary
두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해 설명
Abstract
포유류의 두뇌에서 전체 세포 인구의 약 12 %를 Microglia 계정. 뉴런과 astrocytes는 신경 계통의 주요 세포 유형을 고려하는 동안 microglia는 파편과 병원균을 위해 조직을 모니터링하고 phagocytic 활동 1,2를 통해 실질 조직의 항상성을 유지하여 정상적인 뇌 생리에 중요한 역할을한다. Microglia는 neurodegenerative 질병, 외상성 뇌 손상, 그리고 신경계 감염 3를 포함해 부상과 질병 조건의 수를 동안 활성화됩니다. 이러한 작동 조건에서 microglia은 그들의 phagocytic 활동을 증가 morpohological과 proliferative 변화를 받아야하고, 적극적으로 반응 산소와 질소 종, 프로 - 염증 chemokines 및 크린 시토킨을 분비, 종종 paracrine 또는 autocrine 루프 4-6를 가동합니다. 이 microglial 답변 신경학 조건 질병 pathogenesis에 기여으로 연구 m에 초점을icroglia이 보증됩니다.
두뇌의 세포 이질 때문에, 그것은 생체내 실험의 도중에 고순도로 충분한 microglial 샘플 자료를 얻기 위해 기술적으로 어렵습니다. microglia의 neuroprotective과 neurotoxic 기능에 관한 현재의 연구는 지속적으로 연구를위한 충분한 수율와 순수하고 건강한 microglia를 생성하는 루틴 기술적 방법을 필요로합니다. 우리는, 텍스트 및 비디오에 다운 스트림 애플 리케이션의 다양한 혼합 glia 문화에서 순수 일차 microglia를 분리하기위한 프로토콜을 제시한다. 간단히,이 기술은 혼합 glial 세포 문화를 만들어 신생아 쥐 새끼에서 dissociated 뇌 조직을 활용합니다. 혼합 glial 문화 confluency 도달 후, 일차 microglia는 기계 흔들림의 짧은 기간으로 문화에서 고립된다. microglia 그러면 실험적인 연구를위한 고순도로 도금된다.
이 방법론의 원리와 프로토콜되었습니다문헌 7,8에 설명되어. 또한, 기본 microglia를 분리하기 위해 대체 방법을 잘 9-12 설명되어 있습니다. 균질 뇌 조직은 기본 microglia 12 양보하는 밀도 기울기 원심 분리로 구분됩니다. 그러나, 원심 분리는 적당한 길이 (45 분)입니다 그리고 세포 손상 및 활성화뿐만 아니라, 풍부한 microglia 및 기타 세포 인구를 일으킬 원인이 될 수 있습니다. 다른 프로토콜은 문화 9-11에있는 동안 흔들림 (16 시간) 장기간에 의해 생물의 다양한 기본 microglia를 분리하기 위해 활용되었습니다. 떨고 후 미디어 뜨는는 microglia를 분리 centrifuged있다. 이것은 더 이상 두 단계의 격리 방법도 microglial 기능과 활성화를 교란시키다 있습니다. 우리는 주로 여러 가지 이유로 저희 연구실에서 다음과 microglia 격리 프로토콜을 활용 (1) 기본 microglia (2 더 충실 불후의 쥐 microglia 세포 라인보다 생체내 생물학에서 시뮬레이션) 공칭 기계적 장애는 잠재적인 세포 기능 장애 또는 활성화를 최소화하고, (3) 충분한 수율은 혼합 glial 세포 문화가 통과하지 않고도 얻을 수있다.
그것은이 프로토콜이 microglia를 분리하기 위해 신생아의 쥐 새끼의 뇌 조직을 사용하고 microglia 상당히 고립된 microglia의 이윤율, 정품 인증 상태와 기능적 특성에 영향을 미칠 수있는 분리 이전 쥐를 사용한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 노화가 microglia 부전, 증가 neuroinflammation 및 neurodegenerative pathologies와 연결되어있다는 증거가있다, 그래서 이전의 연구는 노화가 중요한 매개 변수는 어디에 좋은 neurodegenerative 질병에서 microglia의 역할을 이해하기 위해 전직 생체내 성인 microglia를 사용했습니다. 그러나 전직 생체내 microglia는 시간의 장시간 기간 동안 문화에 보관하실 수 없습니다. 이 프로토콜은 문화의 기본 microglia의 수명을 연장하면서 따라서, 그것은 microglia가 D를 행동 것을인지해야생체내 설정에서로 번역하면 ifferently 성인 microglia에서와 체외 연구에서 신중하게 고려되어야합니다.
Protocol
1. 신생아 쥐 뇌 조직의 해부
- 칠이 Leibovitz의 L-15 에어컨 미디어 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1 %의 펜 / Strep) ~ 4 ° C. 따뜻한 문화 미디어 (DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신) 37 가기 ° C. 얼음 냉방 L-15 미디어의 4-5 ML 4 개의 60x15 mm 배양 접시를 준비합니다. 100 % 에탄올 모든 수술 도구를 소독.
- 70 % 에탄올과 P2 신생아 랩 새끼를 씻어. (P1-P5 사이에 세 신생아 쥐 새끼는이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다.)
- 신속 멸균 날카로운 가위로 강아지 쥐의 목을 벨 및 70 % 에탄올로 바로 머리를 놓습니다. 5 쥐 새끼의 총 반복 후 생리 식염수로 머리를 전송합니다.
- 얼음 5 ML L-15 용액 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1퍼센트 펜 / Strep) - 4 페트리 접시에 머리와 장소에서 전체 두뇌를 제거합니다.
- 1.4 쓰레기의 나머지 새끼 용 - 절차 1.2 반복합니다.
- 두뇌에서 meninges를 제거하고 DES를 전송L-15 솔루션의 4-5의 ML과 새로운 배양 접시에 ired 뇌 조직 (즉, 피질, 소뇌, 전체 뇌 등) (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1 %의 펜 / Strep) 얼음.
2. 혼합 Glial 세포 인구의 작성
- 가위 혹은 칼날로 손상 뇌 세포없이는 무균 50 ML 원뿔 튜브에 10 ML의 피펫과 조직을 전송합니다.
- 4 ° C.에서 5 분 2,500 RCF에 원뿔 원심 분리기
- 뜨는을 기음. 신선한 L-15 미디어의 4-5 ML 추가하십시오 (레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % BSA + 1 %의 펜 / Strep).
- 멸균 10 ML의 피펫과 피펫은 조직을 위아래로 10 회.
- 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 세포 스트레이너 (100 μm의 제품 모공)를 놓습니다. 멸균 5 ML 피펫으로하고 셀 스트레이너에 빠질때 피펫과 피펫 한 조직 위아래은 원뿔 튜브에 세포 스트레이너를 통해 자료를 분배.
- 신선한 L-15 미디어의 4-5 ML (와 세포 스트레이너를 씻어 레이 보위 츠 L-15 + 0.1 % 학사+ 1 %의 펜 / Strep).
- 4에서 5 분 동안 2,500 RCF에서 무한 세포와 원뿔 원심 ° C.
3. 혼합 Glial 세포 문화 도금 및 유지 관리
- 각 쥐 새끼 머리가 처리된 경우, 문화, 미디어의 12 ML 추가하여 한 멸균 T-75 플라스크를 준비 (를 DMEM + 10% FBS + 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신) 각 플라스크에.에게
- pelleted 세포에서 뜨는을 기음과 세포 펠렛으로 문화 미디어의 5-6 ML을 추가합니다. 10 ML의 피펫으로 10 배 아래로 피펫합니다.
- 각 T-75 플라스크에 세포 현탁액의 동등한 볼륨을 전송합니다.
- 1~3주 총 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 flasks을 품어.
- Flasks는 처음 5 일 동안 incubated, 그리고 다섯 번째 날에, 신선한 매체의 12 ML 각 플라스크에 문화 미디어를 교체하고 인큐베이터로 돌아가려한다. 그런 다음, 매 3 일 합류를 달성하기위한 새로운 매체의 12 ML 각 플라스크에 갖추어진 미디어를 대체합니다. 이것은 어떻게해야NE는 매우 신중하게 세포 부착 flasks의 바닥에 닿지 않고.
4. 차 Microglia의 분리 및 도금
- 혼합 glial 문화가 완전히 합류 후에는 인큐베이터에서 flasks를 제거하고 환경 공기 가스 교환을 방지하기 parafilm있는 술병 뚜껑을 포괄합니다.
- 37에서 1 시간 동안 100 rps (랩 동반자 SI-600, Jeio 테크)에서 flasks 흔들어 ° C.
- 플라스크 표면에 astrocyte 레이어를 중단하지 않고 10 ML의 피펫을 가진 모든 flasks에서 미디어를 수집합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 미디어를 넣습니다. 인큐베이터에 flasks 및 반품 flasks에 신선한 미디어를 추가합니다.
- 4에서 5 분 동안 2,500 RCF에서 원뿔 튜브를 원심 ° C.
- 모든 원뿔 튜브의 표면에 뜨는을 기음. 세포 펠렛은 고순도 microglia 세포입니다. microglia 도금 미디어 (DMEM + 10 % FES + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신) 1 ML에 Resuspend 쥐똥.
- 사용 resuspended 매체 셀 밀도를 세어hemocytometer.
- ML 밀도 당 2 X 10e5 세포를 달성하기 위해 microglia 도금 매체의 적절한 볼륨을 추가합니다. 실험 분석을 위해 적절한 플레이트.
- microglia는 하룻밤 사이에 부착하도록 허용합니다.
5. 대표 결과
프로토콜은 고순도 기본 microglia 문화에 결과를 위에서 설명한. 로 대식 세포 / 세포 microglia 특정 마커 (Iba1)에 immunohistochemistry에 의해 결정, 도금 microglia 문화 정보> 90% 순수 (그림 2)입니다. 또한 astrocyte, oligodendrocyte 및 신경 세포 세포 특정 마커에 대해 더럽히는 것은 최소한의 오염 (그림 2)를 보여줍니다. 혼합 glial 세포 문화를 맺은 후, microglia은 4 연속 시간까지 흔들어에 의해 격리 수 있습니다. 초기 microglia 절연은 약 2.2 X 106 세포 / ML 또는 10 flasks 및 예상 수확량 약 9,000,000 세포가 각각의 연속된 SHA와 감소를 얻을 것입니다KE. 이 방법에 의해 격리 Microglia는 phagocytosis 능력과 같은 질소 산화물 생산과 같은 기능과 독성의 연결 (그림 3) 13-14를 조사하기 위해 성공적으로 사용되었습니다.
그림 1. 혼합 glial 세포 배양 및 기본 microglia의 절연을 준비하기위한 프로토콜의 개요.
그림 2. 같은 astrocyte microglia (Iba-1, 빨강), (GFAP, 녹색), 신경 세포 (NeuN, 빨강)와 oligodendrocyte를 사용 immunohistochemical 분석에 의해 검증 고순도 microglia의 절연 (CC1, 빨강) 특정 마커. DAPI (파란색)에 의해 문화에 세포의 DNA를 염색법도 표시됩니다.
그림 3. Microglia는 방법 descri에 고립침대를 포함한 assays의 숫자에 사용하지만, phagocytosis의 assays, 함수 assays와 neurotoxicity 연구에 국한되지되었습니다. 이러한 연구에서 우리는 () 또는 LPS (B) 처리 미디어, 계량하실 수 있습니다 fluorescently 레이블 라텍스 구슬 (빨간색), (그들의 phagocytosis를 증가 microglia (Iba-1 양성, 녹색)를 통제할 수 있도록 노출된 경우 것으로 나타났습니다 C). 또한, LPS (1ng/ml) 치료는 microglia (D)에서 질소 산화물의 생산을 늘릴 수 있습니다. 마지막으로, transwell 삽입 구분 또는 직접 microglia - 신경 세포 배양 모두를 통해, 우리는 락트 산 탈수소 효소 (LDH) 릴리스 (E, F)에 의해 측정으로 LPS와 incubated microglia가의 연결을 세포 죽음을 유도 것으로 나타났습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 정기적으로 연구 실험을위한 순수하고 건강한 microglia를 생성하기 위해 이용되는 동안 절차의 중요한 부분 중에 기술적인 관점의 신중한 검토가 고립된 microglia의 변화를 최소화합니다. 첫째, 제시간에 작업 신생아 쥐 새끼의 뇌 조직의 해부 동안 조직에 hypoxic 및 허혈성 손상을 최소화해야합니다. 그러나 meninges의 존재는 이러한 문화 조건 하에서 그들의 빠른 확산 속도로 인해 상당한 fibroblast 오염에 기여하는 것이기 때문에 완전히 절개하는 동안 두뇌에서 meningeal 덮개를 제거하는 것도 중요합니다.
혼합 glial 세포 배양의 준비 기간 동안 조직 물질 둘째, 부드러운 핸들링은 세포 손상, 사망, 또는 과도한 microglial 활성화를 제한하는 것도 중요하다. 문화 미디어를 추가할 때주의가 astrocyte 월을 손상하지 않도록 복용해야olayer. 또한, microglia 분리에 대한 flasks 흔들어 흔들어의 빈도를 조정하면서하면 sloshing이나 미디어에서 공기 거품의 형성을 방지해야 할 수도 있습니다. 이러한 이벤트는 astrocyte 오염을 늘리거나 문화에 세포 손상을 줄 수 있습니다. 실험실에서이 기술을 개발하면 astrocyte 오염없이 microglia의 원하는 수율을 얻기 위해 흔들어 력과 지속 시간을 증가하기 전에 낮은 강도 물리적인 진동 (예 : 100 RPM)로 시작하고 현미경에 의한 세포 배양과 뜨는을 관찰해야 할 수도 있습니다.
실험실에서이 프로토콜의 최적화를하는 동안 또 다른 고려 사항은 시간 혼합 glial 세포 배양 기간이 결정되고는 도금에 대한 기본 microglia를 분리하기 전에 유지되어야합니다. 초기 격리는 1-3주 사후 문화 구축에서 발생할 수 있지만, astrocyte 단일층에서 microglia의 confluency는 다를 및 년 5 월 것이다하류 실험에서 fluence microglial 생물학. 떨고 절차 사이에 지정된 기간에 비해 또한, 동일한 혼합 glial 세포 배양에서 후속 isolations는 문화의 confluency에 기초해야 할 수도 있습니다. 또한, 후속 절연 감소에서 항복 이후, 그것은 기본 microglia의 세포 특성 마지막으로 고립에 처음부터 다를 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 따라서 실험은 microglia 고립된 때주의 표기법과 복제 기술로 진행되어야한다.
이 프로토콜은 쥐의 새끼 두뇌, microglia의 성공적인 고립에서 microglial 고립을 설명하면서 마지막으로, 또한 척수 코드로, 마우스 및 기타 신경 조직을 사용하여 얻을 수 있습니다. 프로토콜에 어떤 중요한 변화 혼합 문화의 초기 도금 배급 (즉, 2 마우스 brains/T75 플라스크 또는 3-4 척수 공동을 증가 넘어, 이러한 대안 microglia 자원에 대한 필요가 없습니다P2의 쥐 pups/T75 플라스크에서 RDS). 예상되어지는대로 또한, 전지 생산량은 감소 시작하는 재료에 따라 감소하는 경향이있다. 그러나, 마우스 뇌 조직을 사용하여 낮은 수율을 얻기에도 불구하고 한 가지 큰 장점은 분자 microglia 생리학의 메카니즘과 형질 전환 생쥐에서 뇌 세포를 사용하여 반응을 조사할 수 중입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
제복 차림의 서비스 대학 교내 프로그램에 의해 자금 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
