Summary
Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules microgliales
Protocol
1. Dissection des tissus de cerveau de rat nouveau-né
- Refroidissement Leibovitz L-15 milieux conditionnés (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) à 4 ° C. Milieux de culture chaudes (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) à 37 ° C. Préparer 4 60x15 mm boîtes de Pétri avec 4-5 ml de L-15 climatisées médias sur la glace. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec de l'éthanol 100%.
- Rincer les chiots nouveau-nés P2 rap avec de l'éthanol 70%. (Ratons nouveau-nés âgés de P1 à P5 peut être utilisé dans ce protocole.)
- Rapidement décapiter un raton avec des ciseaux bien aiguisés stériles et déposer la tête immédiatement dans l'éthanol à 70%. Répétez l'opération pour un total de 5 ratons ensuite transférer la tête dans une solution saline.
- Retirez les cerveaux entiers de la tête et les placer dans une boîte de Pétri avec 4 - 5 ml solution L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + 1% Pen / Strep) sur la glace.
- Répéter les procédures 1.2 - 1.4 pour les chiots qui restent dans la litière.
- Retirez les méninges du cerveau et de transférer le destissu cérébral IRED (c.-à-cortex, le cervelet, le cerveau entier, etc) dans un nouveau plat de Pétri avec 4-5 ml de solution de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) sur la glace.
2. Préparation de la population de cellules gliales mixte
- Sans endommager le tissu cérébral avec des ciseaux ou une lame, transférer le tissu avec une pipette de 10 ml à 50 ml une stérile tube conique.
- Centrifuger conique à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant. Ajouter 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% + 1% BSA Pen / Strep).
- Introduire à la pipette des tissus de haut en bas 10 fois avec une pipette stérile de 10 ml.
- Placer un tamis cellulaire (100 pores um) sur un nouveau tube de 50 ml conique. Tissus pipette de haut en bas une fois avec une solution stérile de pipette 5 ml et que la pipette au ras de la crépine cellule, distribuer le matériau à travers la crépine cellule dans le tube conique.
- Rincer la crépine cellule avec 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% BSUn stylo + 1% / Strep).
- Centrifuger conique avec des cellules tendues à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
3. Placage et d'entretien des cultures mixtes de cellules gliales
- Pour chaque cerveau de rat nouveau-nés traités, préparer 1 T-75 stériles flacon en ajoutant 12 ml de milieux de culture (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) dans chaque flacon.
- Aspirer le surnageant des cellules granulées et ajouter 5-6 ml de milieux de culture pour le culot cellulaire. Introduire à la pipette de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml.
- Transférer un volume égal de suspension cellulaire dans chaque fiole T-75.
- Incuber fioles dans un 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C pour un total de 1-3 semaines.
- Flacons devrait d'abord être incubées pendant 5 jours, et le cinquième jour, remplacer les milieux de culture dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais et retourner à l'incubateur. Puis, tous les 3 jours, remplacer les milieux conditionnés dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais pour atteindre la confluence. Ce doit être le fairene très attentivement sans toucher le fond des flacons où les cellules se fixent.
4. Isolement et Revêtement de l'enseignement primaire microglies
- Après mixtes cultures gliales sont complètement confluentes, retirez flacons de l'incubateur et les caches flacon avec du parafilm pour éviter les échanges gazeux avec l'air ambiant.
- Agiter flacons à 100 RPS (Companion Lab SI-600, JEIO Tech) pendant 1 heure à 37 ° C.
- Recueillir les médias de tous les flacons avec une pipette de 10 ml, sans perturber la couche d'astrocytes à la surface ballon. Placez le support dans des tubes de 50 ml coniques. Ajouter des milieux frais aux flacons et bouteilles de retour à l'incubateur.
- Centrifuger les tubes coniques à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
- Aspirer surnageant de tous les tubes coniques. Les culots cellulaires sont élevés cellules de la microglie de pureté. Pellets Remettre en suspension dans 1 ml de placage microglie médias (DMEM + FES 10% + 1% de pénicilline / streptomycine).
- Comptez la densité cellulaire dans les médias remises en suspension à l'aideun hémocytomètre.
- Ajouter un volume approprié de géloses microglies pour atteindre un 2 x 10E5 cellules par ml de densité. Plate comme il convient pour l'analyse expérimentale.
- Autoriser les microglies pour attacher la nuit.
5. Les résultats représentatifs
Le protocole décrit ci-dessus les résultats dans les cultures primaires de haute pureté microglie. Comme déterminé par immunohistochimie pour un marqueur cellulaire de macrophages / microglies spécifique (Iba1), plaqués cultures microglies sont> à 90% (figure 2). En outre, la coloration des marqueurs de cellules astrocytes, oligodendrocytes et des neurones spécifiques démontre une contamination minimale (figure 2). Après avoir établi mixtes cultures de cellules gliales, la microglie peut être isolé en secouant jusqu'à 4 fois successives. L'isolement initial microglie donnera environ 2,2 x 106 cellules / ml ou environ 9 millions de cellules par 10 flacons et le rendement attendu diminue à chaque sha successifske. La microglie isolés par cette méthode ont été utilisées avec succès pour étudier la capacité de phagocytose, la fonction, comme la production d'oxyde nitrique, et la toxicité neuronale (Figure 3) 13-14.
Figure 1. Vue d'ensemble du protocole de préparation de cultures mixtes de cellules gliales et l'isolement de la microglie primaire.
Figure 2. Isolement de la microglie de haute pureté tel que vérifié par une analyse immunohistochimique utilisant la microglie (Iba-1, rouge), des astrocytes (GFAP, vert), neurone (NeuN, rouge) et des oligodendrocytes (CC1, rouge) des marqueurs spécifiques. La coloration de l'ADN des cellules en culture par DAPI (en bleu) est également indiquée.
Figure 3. Microglie isolés dans la descri méthodelit ont été utilisées dans un certain nombre de tests, y compris, mais sans s'y limiter, les dosages, les dosages de la fonction de phagocytose et des études de neurotoxicité. Dans ces études, nous avons constaté que la microglie (Iba-1 positive, vert), lorsqu'ils sont exposés à contrôler (A) ou LPS (B) des médias traités, augmenter leur phagocytose de billes de latex marquées par fluorescence (rouge), qui peuvent être quantifiées ( C). En outre, le LPS (1ng/ml) le traitement peut augmenter la production d'oxyde nitrique dans la microglie (D). Enfin, via à la fois transwell insert-séparés ou directs microglie-neurones cultures, nous avons constaté que les microglies incubées avec LPS peuvent induire la mort des cellules neuronales, telle que mesurée par la lactate déshydrogénase (LDH) de libération (E, F).
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Discussion
Alors que ce protocole est régulièrement utilisé pour produire la microglie pur et sain pour les expériences de recherche, un examen attentif des aspects techniques au cours de parties critiques de la procédure permettra de minimiser la variabilité dans la microglie isolée. Tout d'abord, lors de la dissection du tissu cérébral de rats nouveau-nés petits, travaillant en temps opportun est nécessaire pour minimiser les dommages hypoxiques et ischémiques du tissu. Cependant, il est également important d'enlever complètement le revêtement méningé du cerveau lors de la dissection, car la présence de méninges contribuera à la contamination des fibroblastes significative en raison de leur taux de prolifération rapide dans ces conditions de culture.
Deuxièmement, une manipulation en douceur de la matière du tissu lors de la préparation de la culture de cellules gliales mixte est également important de limiter les dommages cellulaires, la mort, ou excessive activation de la microglie. Lors de l'ajout des milieux de culture, il faut prendre soin de ne pas endommager le lun. astrocyteolayer. En outre, tout en agitant les flacons pour l'isolement des microglies, réglage de la fréquence des secousses peuvent être nécessaires pour prévenir ballottement ou la formation de bulles d'air dans les médias. Ces événements peuvent augmenter la contamination des astrocytes ou causer des dommages aux cultures de cellules. Lors de l'élaboration de cette technique dans le laboratoire, il peut être nécessaire de commencer avec une agitation faible résistance physique (par exemple 100 tours par minute) et d'observer la culture de cellules et le surnageant par microscopie avant d'augmenter la force et la durée secouant pour obtenir un rendement souhaité de la microglie, sans contamination des astrocytes.
Une autre considération lors de l'optimisation de ce protocole dans le laboratoire est de déterminer la durée de temps de cultures mixtes de cellules gliales devrait être maintenue avant d'isoler les microglies primaire pour le placage. Bien que l'isolement initial peut se produire de 1 à 3 semaines après la culture d'établissement, la confluence de la microglie sur la monocouche d'astrocytes sera différent et peut, dansla biologie fluence microgliale dans les expériences en aval. En outre, isolations ultérieures de la même culture de cellules gliales mixte peuvent avoir besoin d'être fondée sur la confluence de la culture par rapport à une durée déterminée entre les procédures tremblantes. En outre, puisque le rendement des baisses d'isolement suivantes, il est important de noter que les propriétés cellulaires de la microglie primaire peut être différente de la première à l'isolement dernier. Ainsi, les expériences devraient être menées dans les domaines technique reproduit avec la notation attention lors microglies sont isolés.
Enfin, alors que ce protocole traite de l'isolement de la microglie de rat cerveaux, l'isolement des petits succès de la microglie peut également être obtenue en utilisant des souris et d'autres tissus nerveux, tels que la moelle épinière. Pas de changement significatif au protocole est nécessaire pour ces sources alternatives microglie, au-delà à augmenter la ration de placage initial pour les cultures mixtes (c.-à-2 souris brains/T75 flacon ou 3-4 co épinièrerds de rat P2 pups/T75 flacon). En outre, comme on pouvait s'y attendre, le rendement cellulaire tend à diminuer en conformité avec le matériau de départ réduite. Cependant, malgré l'obtention d'une baisse des rendements de l'utilisation de tissu cérébral de la souris, un avantage majeur est d'être capable d'étudier les mécanismes moléculaires de la microglie physiologie et la réactivité en utilisant du tissu cérébral de souris transgéniques.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Financé par le programme intra-muros à l'Université en uniforme des services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
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