Summary
脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。
Protocol
1。新生仔ラットの脳組織の解剖
- チルリーボビッツのL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）に4℃暖かい培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）37℃氷の上でエアコンL-15メディアの4-5 mlの4 60X15ミリメートルのペトリ皿を準備します。 100％エタノールを持つすべての手術器具を滅菌する。
- 70％エタノールでP2新生児ラップ子犬をすすぎます。 （P1-P5歳新生児仔ラットは、このプロトコルで使用することができます。）
- 迅速に滅菌鋭いハサミで子犬ラットを刎ねると、70％エタノールにすぐに頭をドロップします。 5仔ラットの合計繰り返した後食塩水に頭を転送します。
- 氷上で5ミリリットルL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％ペン/連鎖球菌） - 4のペトリ皿に頭と場所から全体の頭脳を削除します。
- 1.4リットルの残りの子犬のために - 手順1.2を繰り返します。
- 脳から髄膜を除去し、DESを転送氷の上でL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlの新しいペトリ皿に赤外LEDの脳組織（ すなわち 、大脳皮質、小脳、全脳、など）。
2。混合グリア細胞集団の準備
- ハサミや刃で脳組織を損傷することなく、滅菌50 mlコニカルチューブに10 mlのピペットで組織を転送します。
- 4℃で5分間2500 RCFで円錐形の遠心
- 上清を吸引除去する。新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlを追加します。
- 滅菌した10 mlのピペットでピペットは、組織の上下に10回。
- 新鮮な50 mlコニカルチューブにセルストレーナー（100μm以下の細孔）を配置します。上下にピペット組織は一度滅菌5mlのピペットを用いて、セルのストレーナーにフラッシュピペットを用いて、コニカルチューブに細胞ストレーナーを通して材料を分配する。
- 新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BS 4-5 mlのセルストレーナーを洗浄します+ 1％のペン/連鎖球菌）。
- 4℃で5分間で2,500 RCFで緊張した細胞と円錐形の遠心分離
3。混合グリア細胞培養のメッキとメンテナンス
- 処理された各ラット子犬の脳については、各フラスコに培養培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）の12 mlを加えて1滅菌T-75フラスコを準備します。
- ペレット化した細胞からの上清を吸引除去し、細胞ペレットに培地の5-6 mlを加える。 10 mlのピペットで10回ピペッティングします。
- それぞれのT-75フラスコに細胞懸濁液の等量を転送します。
- 1-3週間の合計で37℃5％CO 2インキュベーター内でフラスコをインキュベートします。
- フラスコは、最初の5日間インキュベートし、5日目に、新鮮な培地12 mlを各フラスコに培地を交換し、インキュベーターに戻す必要があります。その後、3日ごとに、合流を達成するために新鮮な培地を12 mlの各フラスコ内の培地を交換してください。これは何されている必要があり細胞が付着フラスコの底に触れることなく、非常に慎重にね。
4。プライマリミクログリアの分離とめっき
- 混合グリア培養が完全にコンフルエントになったら、インキュベーターからフラスコを削除し、環境大気とのガス交換を防ぐためパラフィルムでフラスコのキャップをカバーしています。
- 37℃で1時間に100 RPS（ラボコンパニオンSI-600、Jeioテック）でフラスコを振る℃に
- フラスコ表面に星状膠細胞層を中断せずに10 mlのピペットを用いてすべてのフラスコから培地を収集します。 50 mlコニカルチューブにメディアを配置します。インキュベーターにフラスコと戻りフラスコに新鮮な培地を追加します。
- 4℃で5分間で2,500 RCFでコニカルチューブを遠心分離
- すべてのコニカルチューブから上清を吸引除去する。細胞ペレットは、高純度のミクログリア細胞である。ミクログリアメッキ培地（DMEM + 10％FES + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を1mlに再懸濁したペレット。
- を使用して再懸濁した培地で細胞密度を数える血球。
- ミリリットル当たりの密度2×10e5細胞を達成するために、ミクログリアメッキメディアの適切なボリュームを追加します。実験的な解析に適したプレート。
- ミクログリアは一晩にアタッチすることができます。
5。代表的な結果
高純度の主ミクログリア培養の結果、上記のプロトコル。としてマクロファージ/ミクログリア細胞特異的マーカー（Iba1）の免疫組織化学によって決定される、メッキミクログリア培養は> 90％純粋（ 図2）です。さらに、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロン細胞特異的マーカーを染色すると、最小限の汚染（ 図2）を示しています。混合グリア細胞培養を確立した後、ミクログリアは4つの連続した回まで振とうすることにより単離することができる。初期ミクログリアの分離は、約2.2×106細胞/ mlまたは10フラスコ当たり約9万個の細胞が得られると予想される収量は、それぞれの連続したSHAとともに減少するKE。この方法により単離されたミクログリアが貪食能力など、一酸化窒素の生産として機能し、神経毒性（ 図3）13 から14を調査するために首尾よく使用されています。
図1混合グリア細胞培養、プライマリミクログリアの分離を準備するためのプロトコルの概要。
ミクログリア（IBA-1、赤）、アストロサイト（GFAP、緑）、ニューロン（NeuN、赤）とオリゴデンドロサイト（CC1、赤）は、特定のマーカーを用いて免疫組織化学的分析によって検証として高純度のミクログリアの図2。分離。 DAPI（青）で培養中の細胞のDNAを染色も表示されます。
図3ミクログリアは、メソッドdescriで分離されたベッドは、貪食アッセイ、機能アッセイと神経毒性の研究に限定を含むではなく、多くのアッセイで使用されています。これらの研究で、我々が制御するために露出したミクログリア（IBA-1陽性、緑）、（）またはLPS（B）が扱われているメディアを発見した、定量することができる蛍光標識ラテックスビーズ（赤）、それらの貪食を増加させる（ C）。さらに、LPS（1ng/ml）治療は、ミクログリア（D）で一酸化窒素の産生を増加させることができます。最後に、トランスウェルインサート区切りまたは直接ミクログリア - ニューロン培養の両方を介して、我々は、乳酸脱水素酵素（LDH）放出（E、F）によって測定されたLPSとともにインキュベートしたミクログリアが神経細胞死を誘導できることを見出した。
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Discussion
このプロトコルは定期的に研究実験のための純粋で健康的なミクログリアを製造するために利用されていますが、手順の重要な部分の間に技術的な側面を慎重に検討は、単離されたミクログリアの変動を最小限に抑えることができます。まず、タイムリーで働く新生児の仔ラットの脳組織の解剖中に組織への酸素および虚血性損傷を最小限にする必要があります。しかし、髄膜の存在がこれらの培養条件下で、その急速な増殖速度に起因する重要な線維芽細胞の汚染に貢献していきますので、完全に、解剖時に脳から髄膜の被覆を除去するためにも重要です。
混合グリア細胞培養の準備中に組織材料の第二に、穏やかな処理は細胞の損傷、死亡、または過度のミクログリアの活性化を制限することも重要です。培地を追加する場合、注意がアストロ月に損傷を与えないように注意する必要がありますolayer。ミクログリアを分離するためにフラスコを振とうしながらさらに、揺れの周波数を調整するスロッシングやメディアの気泡の形成を防止するために必要があるかもしれません。これらのイベントは、星状膠細胞の混入を増やすか、文化への細胞の損傷を引き起こす可能性があります。実験でこの手法を開発する際には、揺れの物理的な低強度で開始する必要がある（ 例えば、100 rpm）とアストロサイトの汚染せずにミクログリアの所望の収量を得るために加振力と持続時間を増やす前に、顕微鏡で細胞培養上清を観察することが可能です。
研究室では、このプロトコルの最適化中に別の考慮は、混合グリア細胞培養をめっきするための主要ミクログリアを分離する前に維持しなければならない時間の長さを決定しています。最初の分離は1〜3週間後の文化の確立から発生することができますが、星状膠細胞単層上でミクログリアの集密度は異なっており、5月でしょう下流の実験ではフルエンスミクログリア生物学。手順を振っての間に指定された期間に比べて、さらに、同じ混合グリア細胞培養からの後続のアイソレーションは、文化の密集度に基づいてする必要があります。さらに、その後の絶縁が低下するから収量ので、それは主要なミクログリアの細胞の特性は最初から最後分離に異なる場合があります注意することが重要です。したがって、実験はミクログリアが単離されたときの慎重な表記法で複製する技術で実施されるべきである。
このプロトコルは、ラットの子犬の脳からミクログリアの分離を説明しながら、最後に、ミクログリアの成功したアイソレーションは、また、マウスや脊髄などの他の神経組織を使用して達成することができます。プロトコルには有意な変化は、混合培養の初期メッキ比（ すなわち 、2つのマウスbrains/T75フラスコまたは3-4脊髄COを増加させる以外に、これらの代替ミクログリアソースの必要はありませんP2ラットpups/T75フラスコからRDS）。さらに、予想されるように、細胞の収率は減少し、出発物質に応じて減少する傾向にある。しかし、マウスの脳組織を用いて、より低い利回りを得るにもかかわらず、一つの大きな利点は、トランスジェニックマウスからの脳組織を用いたミクログリア生理学と反応性の分子機構を調べることができるようにされている。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
制服サービス大学の学内プログラムによって資金を供給。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R.
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H.
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
