Summary
Isolering primære microglia fra cellulær heterogenicitet i hjernen er vigtigt at undersøge deres rolle i både fysiologiske og patologiske tilstande. Denne protokol beskrives en mekanisk isolation og blandet cellekultur teknik, som tilvejebringer et højt udbytte og høj renhed, levedygtige primære mikrogliaceller celler til
Abstract
Microglia udgør ca 12% af den totale cellepopulation i pattedyrhjernen. Mens neuroner og astrocytter betragtes de primære celletyper i nervesystemet, microglia spiller en væsentlig rolle i normal hjerne fysiologi ved overvågning væv for snavs og patogener, og opretholdelse af homeostase i parenchymet via fagocytisk aktivitet 1,2. Mikroglia aktiveres i løbet af en række skader og sygdomme, herunder neurodegenerative sygdomme, traumatisk hjerneskade, og nervesystemet infektion 3. Under disse aktiverende betingelser øger microglia deres fagocytiske aktivitet, underkastes morpohological og proliferativ ændringer og aktivt udskiller reaktive oxygen-og nitrogenforbindelser, pro-inflammatoriske kemokiner og cytokiner, der ofte aktivere en parakrin eller autokrin sløjfe 4-6. Da disse microgliale reaktioner bidrager til sygdom patogenese i neurologiske lidelser, forskning fokuseret på microglia er berettiget.
På grund af cellulær heterogenicitet i hjernen, er det teknisk vanskeligt at opnå tilstrækkelig mikroglial prøvematerialet med høj renhed under in vivo-forsøg. Aktuel forskning i de neuroprotektive og neurotoksiske funktioner mikroglia kræver en rutinemæssig teknisk metode til konsekvent at generere ren og sund mikroglia med tilstrækkelig udbytte for at studere. Vi præsenterer i tekst og video, en protokol til at isolere rene primære mikroglia fra blandede glia kulturer til en række af downstream applikationer. Kort fortalt denne teknik anvender dissocieret hjernevæv fra neonatale rotteunger at fremstille blandede glia-cellekulturer. Efter de blandede glia kulturerne når konfluens, er primære microglia mekanisk isoleret fra kulturen ved en kort varighed af omrystning. De microglia udplades derefter ved høj renhed til eksperimentel undersøgelse.
Princippet og protokol af denne metode har væretbeskrevet i litteraturen 7,8. Derudover er alternative metoder til at isolere primære mikroglia velbeskrevet 9-12. Homogeniseret hjernevæv kan adskilles ved densitetsgradientcentrifugering til opnåelse primære microglia 12. Imidlertid centrifugering er af moderat længde (45 min) og kan forårsage cellulær skade og aktivering samt bevirke beriget microglia og andre cellepopulationer. En anden protokol er blevet anvendt til at isolere den primære microglia i en række organismer ved langvarig (16 timer) rystning, mens i kultur 9-11. Efter omrystning mediet supernatanten centrifugeret for at isolere microglia. Denne længere totrins-isolation Fremgangsmåden kan også forstyrre mikroglial funktion og-aktivering. Vi primært bruge følgende mikroglia isolation protokol i vores laboratorium for en række årsager: (1) primær mikroglia simulerer in vivo biologi mere trofast end udødeliggjorde gnaver mikroglia cellelinjer, (2) Nominel mekanisk sprængning minimerer potentialet cellulær dysfunktion eller aktivering, og (3) tilstrækkelig udbytte kan opnås uden passage af de blandede glial cellekulturer.
Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol bruger hjernevæv fra nyfødte rotteunger at isolere mikroglia og at brugen af ældre rotter til at isolere mikroglia kan i høj grad påvirke udbyttet, aktivering status og funktionelle egenskaber af isolerede mikroglia. Der er tegn på, at aldring er forbundet med mikroglia dysfunktion, øget neuroinflammation og neurodegenerative sygdomme, har det tidligere undersøgelser anvendes ex vivo voksen mikroglia til bedre at forstå betydningen af mikroglia i neurodegenerative sygdomme, hvor ældning er vigtig parameter. Imidlertid kan ex vivo microglia ikke holdes i kultur i længere perioder. Derfor, mens denne protokol forlænger levetiden af primær mikroglia i kultur, skal det bemærkes, at mikroglia opfører differently fra voksne mikroglia og in vitro undersøgelser bør overvejes nøje, når oversættes til en in vivo omgivelser.
Protocol
1. Dissektion af Neonatal rottehjernevæv
- Chill Leibovitzs L-15 konditionerede medier (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) til 4 ° C. Varme kulturmedier (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin) til 37 ° C. Fremstilling af 4 60x15 mm petriskåle med 4-5 ml af det konditionerede L-15 medie på is. Sterilisere alle kirurgiske værktøjer med 100% ethanol.
- Skyl P2 neonatale rap hvalpe med 70% ethanol. (Neonatale rotteunger alderen P1-P5 kan anvendes i denne protokol.)
- Hurtigt halshugge en rotteunge med steril skarpe saks og slippe hovedet straks ind i 70% ethanol. Gentag for en total af 5 rotteunger derefter overføre hoveder i saltopløsning.
- Fjerne hele hjerner fra de hoveder og anbringes i en petriskål med 4 - 5 ml L-15 opløsning (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) på is.
- Gentag procedurer 1.2 - 1.4 for de resterende hvalpe i kuldet.
- Fjerne meninges fra hjernen og overføre desIRED hjernevæv (dvs. cortex, cerebellum, hel hjerne, etc.) i en ny petriskål med 4-5 ml L-15-opløsning (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) på is.
2. Fremstilling af blandede Glial cellepopulation
- Uden at beskadige hjernevæv med en saks eller en kniv, overføres vævet med en 10 ml pipette til et sterilt 50 ml konisk rør.
- Centrifugeres konisk ved 2500 RCF i 5 minutter ved 4 ° C.
- Aspirere supernatant. Tilsættes 4-5 ml af frisk L-15 medium (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Pipetten væv op og ned 10 gange med en steril 10 ml pipette.
- Placere en cellefilter (100 um porer) på et frisk 50 ml konisk rør. Pipetten væv op og ned en gang med en steril 5 ml pipette, og med pipetten flugter med cellefilter, dispensere materialet gennem cellefilter ned i den koniske rør.
- Skyl cellefilter med 4-5 ml frisk L-15 medium (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Centrifuger konisk med belastede celler ved 2500 RCF i 5 minutter ved 4 ° C.
3. Plating og vedligeholdelse af blandet Glia Cell Cultures
- For hver rotteunge hjerne behandlede fremstille 1 sterile T-75 kolbe ved tilsætning af 12 ml dyrkningsmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin) til hver kolbe.
- Aspirer supernatanten fra de pelleterede celler, og der tilsættes 5-6 ml af dyrkningsmedier til cellepelleten. Pipettere op og ned 10 gange med en 10 ml pipette.
- Overføre et tilsvarende volumen cellesuspension til hver T-75 kolbe.
- Inkuber kolber i en 5% CO2-inkubator ved 37 ° C i i alt 1-3 uger.
- Kolber bør først inkuberes i 5 dage, og på den femte dag, dyrkningsmedierne erstatter i hver kolbe med 12 ml af friske medier og vende tilbage til kuvøsen. Derefter hver 3. dag, erstatte de konditionerede medier i hver kolbe med 12 ml frisk medium for at opnå konfluens. Dette skal gørene meget omhyggeligt uden at røre bunden af kolberne, hvor cellerne vedhæfte.
4. Isolering og Plating af primær Mikroglia
- Efter blandede glia kulturer er fuldstændig sammenflydning, fjernes kolber fra inkubatoren og omfatter kolbens hætter med parafilm at forhindre gas-udveksling med omgivende luft.
- Rystekolber ved 100 RPS (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) i 1 time ved 37 ° C.
- Indsamle medier fra alle kolber med 10 ml pipette uden at forstyrre det astrocyt lag på kolben overfladen. Anbring mediet i 50 ml koniske rør. Tilsættes frisk medium til kolberne og retur kolber til inkubatoren.
- Centrifugeres koniske rør ved 2500 RCF i 5 minutter ved 4 ° C.
- Aspirere supernatant fra alle koniske rør. Cellepellets høj renhed mikroglia celler. Resuspender pellets i 1 ml mikroglia udpladning medier (DMEM + 10% FES + 1% penicillin / streptomycin).
- Tæller celledensiteten i de resuspenderede medier medet hæmocytometer.
- Tilsættes en passende mængde af mikroglia udpladningsmedier at opnå en 2 x 10e5 celler per ml densitet. Plate hvad der er relevant for eksperimentel analyse.
- Tillader microglia at binde natten over.
5. Repræsentative resultater
Den ovenfor beskrevne protokol resulterer i høj renhed primære mikroglia kulturer. Som bestemt ved immunohistokemi for en makrofag / microglia cellespecifik markør (Iba1), belagte mikroglia kulturer> 90% rene (figur 2). Derudover farvning for astrocyt, oligodendrocyt og neuron cellespecifikke markører viser minimal kontaminering (figur 2). Efter etablering af blandede glia-cellekulturer, kan microglia isoleres ved omrystning indtil 4 successive tidspunkter. Den indledende microglia isolering vil give cirka 2,2 x 106 celler / ml eller ca 9.000.000 celler pr 10 kolber og det forventede udbytte aftager med hver successiv shake. Microglia isoleret ved denne fremgangsmåde er blevet anvendt med held til at undersøge fagocytose evne funktion såsom nitrogenoxidproduktion og neuronal toksicitet (figur 3) 13-14.
Figur 1. Oversigt over protokollen for at forberede blandede gliale cellekulturer og isolering af primær mikroglia.
Figur 2. Isolering af høj renhed mikroglia som verificeret ved immunhistokemisk analyse ved hjælp af mikroglia (IBA-1, rød), astrocyt (GFAP, grøn), neuron (Neun, rød) og oligodendrocyt (CC1, rød) specifikke markører. Farvning for DNA fra celler i kultur ved hjælp af DAPI (blå) er også vist.
Figur 3. Mikroglia isoleret i fremgangsmåden beskrebed er blevet anvendt i en række assays, herunder, men ikke begrænset til, fagocytose assays, funktion assays og Neurotoksicitetsundersoegelser. I disse undersøgelser har vi fundet, at mikroglia (Iba-1 positive, grøn), når de udsættes for styring (A) eller LPS (B) blev behandlet medier øge deres fagocytose af fluorescensmærkede latexperler (rød), som kan kvantificeres ( C). Endvidere kan LPS (1 ng) behandling forøge nitrogenoxidproduktion i microglia (D). Endelig via både transwell insert-separeret eller direkte microglia-neuron kulturer, har vi fundet, at mikroglia inkuberet med LPS kan inducere nervecelledød som målt ved lactatdehydrogenase (LDH) frigivelse (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens denne protokol rutinemæssigt anvendes til at producere ren og sund mikroglia for forskning eksperimenter, vil nøje overvejelse af de tekniske aspekter i kritiske dele af proceduren minimere variabilitet i den isolerede mikroglia. Første under dissektionen af hjernevæv fra neonatale rotteunger, der arbejder i tide er nødvendig for at minimere hypoxisk og iskæmisk skade på vævet. Det er imidlertid også vigtigt for fuldstændigt at fjerne meningeal belægningen fra hjernen under dissektion, fordi tilstedeværelsen af meninges vil bidrage til signifikant fibroblast forurening på grund af deres hurtige proliferation hastighed under disse dyrkningsbetingelser.
Sekund, skånsom håndtering af vævet materiale under fremstillingen af den blandede glia cellekultur er også vigtigt at begrænse cellebeskadigelse, død eller overdreven mikroglial aktivering. Når du tilføjer dyrkningsmedier, bør der udvises forsigtighed for ikke at beskadige astrocyt manolayer. Derudover kan under omrystning af kolberne til microglia isolation, justere frekvensen af omrystning være nødvendig for at forhindre skvulpende eller dannelsen af luftbobler i medierne. Disse begivenheder kan forøge astrocyt kontaminering eller forårsage cellebeskadigelse til kulturerne. Ved udviklingen af denne teknik i laboratoriet, kan det være nødvendigt at begynde med lav styrke fysiske omrystning (fx 100 omdrejninger i minuttet) og observere cellekultur og supernatanten ved mikroskopi for at stige omrystning kraft og varighed til opnåelse af et ønsket udbytte af mikroglia uden astrocyt kontaminering.
En anden overvejelse i løbet af optimering af denne protokol i laboratoriet er vurderingen af varigheden af tiden blandede gliale cellekulturer bør opretholdes, før isolere primære mikroglia til plettering. Mens oprindelige isolering kan forekomme fra 1 til 3 uger efter dyrkning etablering vil konfluens af mikroglia på astrocyt-monolag forskellige og kan ineutronfluens microglial biologi i downstream-eksperimenter. Desuden kan efterfølgende isolering fra det samme blandede glia cellekultur skal baseres på konfluens af kulturen sammenlignet med en specificeret varighed mellem ryster procedurer. Yderligere, eftersom udbyttet af de efterfølgende isolation aftager, er det vigtigt at bemærke de cellulære egenskaber primære microglia kan være forskelligt fra første til sidst isolation. Derfor bør forsøgene gennemføres i teknisk replikater med omhyggelig notation, hvornår mikroglia er isoleret.
Endelig kan mens denne protokol beskrives mikroglial isoleret fra rotteunge hjerne, vellykket isolering af mikroglia også opnås under anvendelse af mus og andre nervevæv, såsom rygmarv. Ingen væsentlige ændringer til protokollen er nødvendigt for disse alternative mikroglia kilder, ud over at øge den indledende udpladning ration for de blandede kulturer (dvs. 2 mus brains/T75 kolbe eller 3-4 spinal coRDS fra P2 rotte pups/T75 kolbe). Hertil kommer, som det ville forventes celleudbytte tendens til at falde i overensstemmelse med den reducerede udgangsmaterialet. Trods opnå lavere udbytter fra anvendelse af muse hjernevæv, er en væsentlig fordel at være i stand til at undersøge de molekylære mekanismer i microglia fysiologi og reaktivitet med hjernevæv fra transgene mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Finansieret af murene program på uniformerede Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
