Summary
在这个协议中，W E 发现了新的黑色素细胞样细胞群（也称为心源性黑色素细胞）的小鼠和人类中，有助于房性心律失常引发小鼠的心。
Abstract
我们确定了一个新的黑色素细胞样细胞群（也称为心源性黑色素细胞），在小鼠中导致房性心律失常触发小鼠和人类的心。调查心脏黑色素细胞的电特性和生物特性，我们开发了一种程序，从小鼠心脏，我们从这些设计以分离新生鼠心肌细胞衍生的隔离。为了获得适合于更广泛的膜片钳或生化研究健康心脏的黑素细胞，我们开发了一种精制方法分离和镀基于那些最初设计以隔离皮肤黑素细胞中黑素细胞的心脏。精致的过程证明了本次审查，并产生更大的健康黑色素细胞样细胞，可作为镀纯人口或心肌细胞的数量。
Introduction
我们最近发现在表达黑色素合成酶和形态上类似皮肤的黑素细胞的小鼠和人类的心脏了一种新的细胞群。我们称这些细胞的黑素心“，发现他们是存在于解剖位置，从该房性心律失常的触发往往起源于人类。我们还发现心脏黑色素细胞在小鼠生殖细胞缺失的DCT导致房性心律失常。心黑素细胞稀疏地分布在整个小鼠心房，他们包括所有心房细胞少于0.1％。调查心脏黑色素细胞的电特性和生物特性，我们开发了一种方法，从使用Cre重组酶诱导的黑素细胞特异性标记物的小鼠心脏隔离。我们的初始步骤，从那些用于分离新生鼠心肌细胞，并产生非常小的数值适用于膜片钳记录或PCR分析细胞的开发。然而，为了提高愈合日和心脏的黑色素细胞，进行更深入的分析，电生理或生化研究的可行性，我们制定了从那些旨在隔离皮肤的黑素细胞精致的过程。描述和展示了在本次审查的程序有生产，可作为镀纯人群或心肌与心脏健康的黑素细胞的优势。
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Protocol
1，准备必要的解决方案和设备
- 首先，通过高压灭菌他们15分钟消毒手术器械（直形镊子，弯形镊子，直板造型剪刀和弯曲的形状剪）。在121℃。准备2台仪器，其中一组用于解剖出来的心和另一组中的将被用于切碎起来的组织。
- 溶解MCDB153培养基1包900毫升的消毒，过滤后的水，搅拌缓慢，直到粉末完全溶解。添加1.2克碳酸氢钠，或毫升钠15.7碳酸氢盐溶液，对于每升培养基的最终体积被制备并进行搅拌直到溶解[w / v的7.5％。将pH调节至7.2，加入任一的1N HCl或1N的NaOH，然后通过在组织培养罩（生物安全柜中）在无菌条件下用0.2微米的瓶顶过滤器倾介质。然后收集媒体，并将其保存在4℃。
- 准备补充添加到培养介质（材料清单）。的补充剂应该被添加到需要的只是在媒体前电镀细胞的培养基。
- 制备DPBS有10％FBS加抗生素（青霉素和链霉素）。
- 至100毫升DPBS加抗生素（青霉素和链霉素）中，接着，通过添加0.25克胰蛋白酶（USB牛胰腺，活动> 2500 USP单位/ mg，超纯水）制备0.25％胰蛋白酶溶液。
- 完成此过程所需的其他必要的设备，包括立体显微镜，培养皿（10厘米），50毫升锥形管，40微米的细胞过滤器，DPBS加用抗生素，60毫米培养皿和35毫米的培养皿。
2，隔离新生乳鼠心脏
- 首先，获得P0到P2新生乳鼠组（n = 6〜8）。建议使用由养殖DCT的Cre重组酶的女性纯合子雄性是杂无论是R26R产生的幼崽：EYFP的等位基因或Z / EG基因标记的黑素细胞样细胞。这两个R26R：EYFP和Z / EG小鼠可以从杰克逊实验室（股票号码006148和003920，分别）。
- 其次，安乐死的新生小鼠幼崽，用酒精棉签擦拭胸前，然后将幼崽在一个10厘米的培养皿用DPBS。
- 切开皮肤在胸腔和胸骨用灭菌镊子和剪刀，然后打开箱子仔细地在立体显微镜下。新生小鼠幼崽的心是非常小的，所以要小心，以确保与连接心房切除整个心脏。
- 在DPBS洗心，将它们转移到一个新的10厘米的培养皿。
3，酶消化
- 把培养皿的切心来组织培养罩（生物安全柜），然后按照下面使用无菌技术，在通风橱中的步骤。
- 首先，洗心三次在无菌的DPBS加用抗生素。
- 将心中（N = 6-8）在60毫米的培养皿中，加入6-8毫升的0.5％胰蛋白酶溶液的培养皿中。
- 接着，切割的心成小块（小于1毫米的大小），并在5％CO 2气氛中孵育它们在37℃下进行30分钟。
- 孵育期结束后，倒入所得的心脏组织，并从盘的胰蛋白酶溶液到无菌的50ml锥形管中。
- 然后，用10毫升无菌吸管，快速而轻，磨碎的50毫升锥形管30-50倍的解决方案。
- 过滤通过一个新的，干净的50毫升锥形管的顶端40微米的细胞过滤网，所得溶液以收集滤液。
- 接着，离心50-ml管中，在240×g下在台式离心机，5分钟，在室温下进行。然后，轻轻地吸上清，悬浮颗粒残留在6-8毫升无菌的DPBS。重复此步骤2次以上。这一步小球心房肌细胞和心脏的黑色素细胞，但不会拖垮网络由于成纤维细胞的成纤维细胞体积较小，将保留在上清液中。
4，电镀黑素细胞心肌样细胞
- 离心后的第三冲洗，小心排出或吸断洗涤液（DPBS），重悬在6ml MCDB培养基的沉淀到该补充剂已被添加。
- 现在，绘制再悬浮液进入无菌移液管，然后将细胞在35毫米的菜，或在6孔板的好，游泳池，距离3新生小鼠离体心肌细胞在一个35毫米的菜或好。
- 孵化菜过夜，在37℃，5％CO 2气氛中，吸脱培养基连同任何未附着的细胞，然后用DPBS冲洗所述板一次。然后加入新鲜培养基，以将板和更换介质每2天。细胞从新生儿或胚胎心脏分离可维持培养达3周，而细胞从成年听到分离TS可被保持在培养长达10天。
从成年小鼠心脏5隔离心黑素细胞样细胞
- 首先，请从成熟老鼠的心（3-4周龄，N = 3）通过给予肝素100单位腹腔注射给小鼠，然后它们实施安乐死后中线胸骨。它建议用戊巴比妥安乐死的小鼠在此过程中，但这种药物是不是在所有地区提供。
- 接下来，洗切心含在组织培养罩（生物安全柜）抗生素无菌DPBS。轻轻挤压心脏采用弧形解剖钳去除他们剩余的血液，然后冲洗心中的DPBS一次。
- 从心里卸下心房和房室环（这些结构含有黑素细胞样细胞），然后将切除的组织标本中有35毫米的菜。
- 用弯剪和切割力的心切成小块PS，然后添加6-8毫升的0.5％胰蛋白酶溶液的培养皿中。然后孵育的菜，在37℃，45〜60分钟。
- 现在，遵循的程序上面的步骤从步骤3.6起开始。
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Representative Results
在这篇文章中描述的协议是相对于我们以前出版的从小鼠心脏心脏分离黑素细胞之一的改进技术。这个过程采用了利用由黑色素合成酶特异性Cre重组酶从动标注心脏黑色素细胞样细胞的荧光标记物。使用的标记物与新鲜分离的胚胎或新生儿细胞中工作时，由于该区分心脏的黑素细胞从心房肌细胞的形态差异尚未发展（ 图1A）标记心脏的黑素细胞是重要的。 如图1A时，分离步骤顺利，相当多的心房肌细胞和心脏黑色素细胞会附着在层粘连蛋白包被培养皿，只需几个非贴壁细胞。在这种情况下，粘附的细胞会出现平放在培养皿（黄色箭头图1A中 ，箭头）的底部。另一方面，在多项式时杜热不能很好地工作大部分细胞将非粘附和经常看球形和向上取整（浅蓝色箭头， 图1A）。
当所述分离的细胞用绿色荧光成像可视化，很清楚哪些细胞是心脏的黑素细胞和其细胞是心房肌细胞（ 图1）。如上述，在协议中提到（步骤3.9）中，成纤维细胞是从使用低力离心该小球更大的心房肌细胞和心肌的黑素细胞，但不带向下越小心脏成纤维细胞分离的心房细胞池中移除。现在可用于单细胞电生理记录（ 图2），单细胞的RNA分析或生化分析的新鲜分离细胞。
我们还培养和使用该协议长达21天保持孤立的新生儿或胚胎心房细胞。使用在此所描述的培养条件协议，心黑素细胞样细胞会进一步分化和增殖，而心房肌细胞倾向于从培养皿分离，并在2-3天内死于他们分离之后。 如图3A所示是健康心脏的黑素细胞，他们从新生小鼠心脏中分离后5天。注意缺乏围绕这些细胞的任何心房肌细胞（相对于图1中示出的新鲜分离的细胞）。此外，这些心脏黑色素细胞已经开发了广泛树枝状突起和接近于皮肤的黑素细胞的也已在培养的天数相同（ 图3B）。
图1：代表（A）DIC和（B）的新鲜íGFP图片从胚胎（E19.5）solated心房细胞DCT的Z / EG鼠标小狗。白色箭头标识在两个面板的心脏的黑素细胞。注意，如果没有在荧光标记物的辅助下，在心脏的黑素细胞是难以识别和从附着到培养皿的心房肌细胞（黄色箭头）区分。淡蓝色的箭头指向没有得到很好的附着于培养皿心房细胞。
图2的DCT - / -心黑素细胞表现出延长动作电位时程。由（A）心脏的DCT +/-和（B）心的DCT电流钳记录- / -细胞显示增加的动作电位时程在没有DCT变换。对DCT +/-细胞静息电位为-62 mV时，同时对DCT - / - 细胞具有的静息电位-60毫伏。转载，经许可后，由莱文等人。 J.临床。投资119，2920年至2936年（2009年）。
图隔离（ 一）3。代表图像心脏黑色素细胞样细胞和（B）皮肤的黑素细胞。黑素是从心灵和新生小鼠（P1）的皮肤，分别隔离，然后再培养5天。
图4的DCT表达细胞植入心脏。 （ 一） 在 E13.5小鼠心脏原位杂交显示表达的DCT（实心箭头）周围的肺静脉OS（开放箭头）。肺静脉内的DCT阳性细胞（箭头）（二）免疫荧光染色。 （三）X线加仑DCT的阳性细胞在E16.5小鼠DCT的LacZ的心脏（箭头）的后庭染色。 （ 深）X-gal染色在E17.5 DCT的LacZ基因小鼠心脏沿RA隔的卵圆孔，冠状静脉窦OS和下腔静脉的区域;插图规模= 500微米。 （五 ）成年小鼠（P60）从跨越DctCre +/-和鼠标R26R导致表明肺静脉与左心房内的LacZ阳性细胞（箭头）。通过在手术去除人肺静脉的内皮细胞的免疫荧光染色（箭头），检测（F），DCT的阳性细胞。规模= 500的所有面板微米，除了面板（B和D，规模为100微米）和小组（F;规模= 50微米）。缩写：光伏，肺静脉;洛杉矶，左心房;敖，主动脉;宾夕法尼亚州，pulmo进制动脉;类风湿性关节炎，右心房;下腔静脉，下腔静脉; FO，卵圆孔; CS，冠状静脉窦。转载，经许可后，由莱文等人。 J.临床。投资 119，2920年至2936年（2009年）。
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Discussion
心黑素细胞存在于心脏内的解剖位置中通常引起心律失常的触发器。这些区域包括肺静脉，房室瓣环，后左心房和卵圆孔（ 图4）。要理解中的作用，这些细胞在心律失常玩，我们开发的技术来隔离他们，研究他们的生理机能。但是，我们认识到，提高该技术以产生更健康，更大量的心脏黑色素细胞将允许进一步的研究，以探讨心脏黑色素细胞对外源性刺激的反应。此外，改进的隔离技术还可以允许研究探讨心脏黑色素细胞与心房肌细胞的正常生理和疾病过程中的相互作用。
本文介绍的程序从我们从设计到ISOL协议开发的小鼠心脏中分离可行的黑色素细胞样细胞吃了从皮肤的黑素细胞。在这个协议中的关键步骤是提取心脏的黑素细胞样细胞。而分离出心脏的黑素细胞从新生儿心脏是相对直截了当的，从成熟的心脏提取心脏的黑素细胞是更加困难的，由于间质纤维化的增加量。在这个协议中，我们所用胰蛋白酶消化以从成熟心脏提取黑色素细胞样细胞。开发这个协议中，我们测试了几种不同的酶组合，即由不同浓度的胰蛋白酶，胶原酶和分散酶的。
我们发现，一种治疗与胶原酶的组合（前30分钟）新生儿心房接着胰蛋白酶（在接下来的15分钟）最初产生的黑素细胞样细胞的产量更高，但分离的细胞不太健康与降低存活率。另一方面，用胰蛋白酶消化单独产生从米健康黑素细胞样细胞的中等数量ature小鼠心脏。因此，我们建议只使用胰蛋白酶隔离成熟鼠心黑素细胞样细胞。此外，我们发现，大力捣碎胰蛋白酶的成熟小鼠心脏消化后所产生的浆液改进可行的黑素细胞样细胞的产率。我们应该指出，胰蛋白酶有消化部分细胞膜通道或电荷载体的潜力，并进行膜片钳研究时，这可能会影响的通道密度。虽然我们没有进行严格的分析，以确定是否胰酶消化的影响隔离的，成熟的黑素细胞样细胞的电流密度我们并没有发现在我们已经使用该协议进行的研究电流或动作电位的任何显著效果。
心黑素细胞样细胞是非常稀疏的细胞群中心脏（所有心房细胞少于0.1％），该形态类似于皮肤的黑素细胞（ 图1及图3 </ STRONG>）。由于这一事实，有存在于心脏相对较少心脏黑素细胞;直到最近，我们只能够使用它们的单细胞分析（ 即膜片钳记录或单细胞PCR）检测。然而，我们已经汇集20-30新生儿或5-8成熟的心灵获得更大量的心脏黑色素细胞，并发现这种方法产生的组织足量进行免疫或生化检测。此外，由于黑素细胞样细胞在小鼠心脏中低数量，能够提高这些细胞的产率，他们已经被分离之后，我们常常将15-20毫米的圆形，特氟隆刀片上使用无菌真空油脂的35-mm培养皿。该细胞可以被放置在插入件内，以减少电镀面积，并增加其密度。使用特氟隆也插入提高黑素细胞样细胞的下列其隔离和在电镀期间以及生存能力。
有些心脏黑色素核细胞样细胞具有双极形态下的隔离，我们相信这代表了这些细胞的分化程度较低的状态。此外，我们发现，3天以下隔离培养心肌黑色素细胞似乎诱导的黑素细胞样表型，其中所述细胞开始形成枝晶的进一步分化。我们还发现，这种协议产生的黑素细胞样细胞，能维持在培养10天成熟心。然而，除了在培养的黑素细胞样细胞成熟的心分离将停止增殖，并可能成为老化10天。分离的和镀心脏黑色素细胞可用于细胞电生理分析或其它分子/细胞的生物分析，如RNA分析或研究，以评估它们的生理反应的外源因子。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由卫生部授予R01 HL105734到VVPMDL国家研究院赞助支持，部分是由健康研究事业奖K08 HL094748国家机构。 VVP是美国心脏协会的创新研究员被授予11IRG900384支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
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