Summary
В этом протоколе, ж е обнаружен новый население меланоцитов-подобных клеток (также известный как сердечные меланоцитов) в сердцах мышей и людей, которые способствуют мерцательная аритмия вызывает у мышей.
Abstract
Мы определили новый население меланоцитов-подобных клеток (также известный как сердечные меланоцитов) в сердцах мышей и людей, которые способствуют предсердий триггеров аритмии у мышей. Для исследования электрических и биологические свойства сердечных меланоцитов мы разработали процедуру, чтобы изолировать их от мыши сердцах, что мы, полученных от тех, предназначены для защиты новорожденных мышиных кардиомиоцитов. Для того чтобы получить здоровые сердечные меланоциты, пригодные для более широкого зажима патч или биохимических исследований, мы разработали изысканный процедуру выделения и покрытие сердечные меланоциты, основанные на тех, которые изначально предназначены для защиты кожных меланоцитов. Изысканный процедура демонстрируется в данном обзоре и производит большее количество здоровых меланоцитов-подобных клеток, которые могут быть покрыты как чисто населения или с кардиомиоцитов.
Introduction
Мы недавно обнаружен новый популяции клеток в сердце мышей и людей, которые выражают меланин-синтеза ферментов и морфологически напоминают кожные меланоциты. Мы назвали "сердечные меланоциты 'Эти клетки и обнаружили, что они присутствуют в анатомических мест, откуда мерцательная аритмия триггеры часто происходят в организме человека. Мы также обнаружили, сердечные меланоциты способствовать предсердий аритмий у мышей с зародышевой линии удаления DCT. Сердечные меланоциты редко распределяется по всему мыши атриум, где они составляют менее 0,1% всех предсердных клеток. Для исследования электрических и биологические свойства сердечных меланоцитов мы разработали процедуру, чтобы изолировать их от сердца мыши, используя Cre-индуцируемый меланоцит специфические маркеры. Наша первоначальная процедура была разработана с тем, которые используются для изоляции новорожденных мышиных кардиомиоцитов и дало очень небольшое количество клеток, пригодных для локальной фиксации записей или ПЦР-анализа. Тем не менее, для улучшения исцелитьй и жизнеспособность сердечной меланоцитов, для более глубокого электрофизиологические анализ или биохимические исследования, мы разработали изысканный процедуру от тех, предназначены для защиты кожных меланоцитов. Процедура, описанная и показано в этом обзоре имеет то преимущество, что производство здоровых сердечных меланоцитов, которые могут быть покрыты в виде чистого населения или кардиомиоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка необходимых решений и оборудования
- Во-первых, стерилизации хирургических инструментов (прямые щипцы форма, пинцетов формы, прямые ножницы формы и изогнутые ножницы формы) в автоклаве их в течение 15 мин. при 121 ° С. Подготовьте 2 комплекта инструментов, где один набор используется для рассечения из сердца и другой набор будет использоваться для измельчения составляющих ткань.
- Растворите 1 пакетик MCDB153 питательных сред в 900 мл стерилизованной, фильтрованной воды и помешивайте, пока порошок не растворится. Добавить 1,2 г бикарбоната натрия, или 15,7 мл раствора бикарбоната натрия [7,5% вес / объем], на каждый литр конечного объема среды быть подготовленный и перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 7,2 путем добавления или 1 N HCl или 1 н NaOH, затем залить СМИ через 0,2 мкм бутылки верхней фильтра в стерильных условиях в капот культуры ткани (биозащитой). Затем соберите СМИ и хранить его при температуре 4 ° С.
- Подготовьте дополненийдобавить в культуральной среде (список материалов). Добавки должны быть добавлены в средствах массовой информации как раз перед носитель, необходимых для посева клеток.
- Подготовьте DPBS с 10% FBS плюс антибиотиков (пенициллина и стрептомицина).
- Далее, подготовить 0,25% раствор трипсина путем добавления 0,25 г трипсина бычьей поджелудочной железы (активность,> 2500 USP единиц / мг, ультрачистой; USB) к 100 мл DPBS плюс антибиотики (пенициллин и стрептомицин).
- Другие необходимые для выполнения этой процедуры необходимое оборудование включают стереомикроскопа, чашках Петри (10-см), 50-мл конических труб, фильтры 40-мкм клеток, DPBS плюс антибиотики, 60-мм чашки для культивирования и 35-мм чашек для культивирования.
2 Изоляция сердца от неонатальных мышей Щенки
- Во-первых, получить P0 до P2 щенков новорожденных мышей (п = 6 до 8). Рекомендуется использовать щенков, генерируемые разведения DCT-CRE гомозиготных самок с самцами, которые гетерозиготных по либо в R26R: EYFP аллеля или Z / EG аллеля для мечениямеланоцитов-подобные клетки. Оба R26R: EYFP и Z / EG мыши можно получить Джексона Laboratories (поголовья 006148 и 003920, соответственно).
- Далее, усыпить неонатальном щенков мыши, протрите их сундуки с спиртовым тампоном, а затем поместить щенков в 10-см чашки Петри с DPBS.
- Разрежьте кожу на груди и грудины с стерилизованные щипцы и ножницы, а затем открыть сундук тщательно под стереомикроскопом. Сердца новорожденных щенков мыши очень малы, поэтому будьте осторожны, чтобы убедиться, чтобы удалить все сердце с предсердий прилагается.
- Вымойте сердца в DPBS и передавать их на новый 10-см чашку Петри.
3 ферментативного расщепления
- Принесите чашку Петри с подакцизным сердца к капот культуры ткани (биозащитой), а затем выполните следующие действия, используя стерильные методы в капюшоне.
- Во-первых, мыть сердцах трижды в стерильных DPBS плюс антибиотиков.
- Поместите сердца (п = 6-8) в60-мм чашки для культивирования и добавить 6-8 мл 0,5% раствора трипсина на блюдо.
- Затем разрезать сердца на мелкие кусочки (менее 1 мм, в размере) и инкубировать их при 37 ° С в течение 30 мин в 5% СО 2 атмосферы.
- После инкубационного периода завершена, залить полученный раствор сердечной ткани и трипсина от блюдо в стерильный 50-мл коническую трубку.
- Затем, используя 10-мл стерильной пипеткой, быстро, но осторожно, растирают решение в 50-мл коническую трубку 30-50 раз.
- Фильтр полученный раствор через сито 40 мкм клетки в верхней части новой, чистой 50-мл коническую трубку для сбора фильтрата.
- Далее, центрифуги 50-мл пробирке при 240 х г в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре. Тогда, мягко аспирации от супернатант и ресуспендируют оставшийся осадок в 6-8 мл стерильного DPBS. Повторите этот шаг еще 2 раза. Этот шаг пеллеты межпредсердной миоцитов и сердечных меланоциты, но не сбить Fiфибробластов Поскольку фибробластов меньше и останется в супернатанте.
4 Покрытие Сердечная меланоцитов-подобные клетки
- После третьего полоскания после центрифугирования, тщательно слить или аспирации от промывочного раствора (DPBS) и ресуспендируют осадок в 6 мл культуральной среды MCDB, к которому были добавлены добавки.
- Теперь нарисуйте ресуспендированные раствор в стерильной пипетки и поместить клетки в 35-мм блюдо или в лунку 6-луночного планшета, и объединить разрозненные сердечные клетки от 3 новорожденных мышей в одной 35-мм блюдо или хорошо.
- Выдержите посуду в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы, аспирация от питательных сред наряду с любыми одиноких клеток, а затем промыть пластины один раз DPBS. Затем добавить свежий СМИ к пластинам и Замените носитель каждые 2 дня. Клетки, выделенные из неонатальной или эмбриональных сердца можно поддерживать в культуре в течение 3 недель, тогда как клетки, выделенные из взрослого слышатьTS может поддерживаться в культуре в течение до 10 дней.
5 Изоляция Сердечная меланоцитов-подобные клетки из взрослых мышей Сердца
- Сначала снимите сердца от зрелой мышей (3-4 недели-старые, п = 3) через середины линии стернотомию после введения гепарина 100 Ед интраперитонеальное мышам, а затем эвтаназии их. Рекомендуется использовать фенобарбитал усыпить мышей для этой процедуры, но этот препарат не во всех регионах.
- Далее, мыть вырезанные сердца в стерильных DPBS содержащих антибиотики в капот культуры ткани (биозащитой). Сожмите сердца слегка изогнутых диссекционные для удаления остатков крови от них, а затем промыть сердца в DPBS еще раз.
- Удалить из предсердий и атриовентрикулярного кольцо из сердец (эти структуры содержат меланоциты как клетки) и поместите вырезанные образцы тканей в 35-мм блюдо.
- Вырезать сердца на мелкие кусочки с помощью изогнутых ножниц и силыпс, а затем добавить 6-8 мл 0,5% раствора трипсина к блюду. Затем инкубируют посуду при 37 ° С в течение 45-60 мин.
- Теперь, выполните шаги с вышеописанной процедуре, начиная с шага 3,6 года.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный в этой статье является улучшенной техникой по сравнению с той, которую мы ранее опубликованной выделения сердечные меланоцитов из мышиного сердца. Эта процедура использует использование флуоресцентных маркеров, управляемых синтеза меланина фермента конкретных Cre-рекомбиназы маркировать сердечные меланоцитстимулирующий как клетки. Важно использовать маркер для обозначения сердечные меланоцитов при работе с Свежевыделенные эмбриональных или неонатальных клеток, так как морфологические различия, которые отличают сердечные меланоциты от предсердий миоцитов еще не разработана (рисунок 1а). Как показано на рисунке 1а, когда шаг изоляции прошло хорошо, довольно большое количество предсердных миоцитов и сердечных меланоцитов будет придерживаться ламинином покрытием блюдо с помощью всего лишь нескольких неадгезивных клеток. В этом случае прилипшие клетки появится квартира на дно тарелки (желтых стрелок Рисунок 1A, стрелок). С другой стороны, когда ProceДюре не работает большинство клеток будет не соблюдают и часто выглядят сферическими и округляется до (голубой наконечники стрел, рис 1а).
Когда отдельные клетки визуализировали с использованием изображений зеленый флуоресцентный, понятно, какие клетки являются сердечные меланоциты и какие клетки являются предсердные миоциты (Рисунок 1). Как упоминалось выше, в протоколе (шаг 3,9), фибробласты, удаляются из пула изолированных предсердных клеток с использованием низкой силы центрифугирования, что гранулы большие предсердные миоциты и сердечных меланоцитов, но не снизить меньшие сердечные фибробласты. В недавно изолированных клеток теперь могут быть использованы для Электрофизиологические записи одного клеток (рисунок 2), одного анализа клеточной РНК или биохимических анализов.
У нас есть также культивируют и поддерживают отдельные новорожденных или эмбриональные клетки предсердий с использованием этого протокола на срок до 21 дней. Использование условий культивирования, описанных в данномПротокол, сердечные меланоцитов, как клетки будут дальнейшей дифференциации и пролиферации, в то время как предсердные миоциты, как правило, оторваться от тарелки и умирают в течение 2-3 дней после того как они изолированы. Показано на рисунке 3А здоровые сердечные меланоциты 5 дней после того как они были изолированы от новорожденных сердце мыши. Обратите внимание на отсутствие любых предсердий миоцитов вокруг этих клеток (в отличие от свежевыделенных клеток, показанных на рисунке 1). Кроме того, эти сердечные меланоциты разработали обширные дендритные процессы и напоминают кожных меланоцитов, которые также были в культуре в течение того же количества дней (фиг.3В).
Рисунок 1 представитель () DIC и (B) GFP образы свежемолотым Isolated предсердные клетки эмбриональной (E19.5) Dct-Z / EG мыши щенка. Белая стрелка указывает на сердечную меланоцитстимулирующий в обеих панелей. Обратите внимание, что без помощи флуоресцентного маркера, сердечная меланоцитов трудно определить и отличить от предсердий миоцитов (желтые стрелки), прикрепленных к блюду. В светло-голубые стрелки указывают на предсердных клеток, которые не очень хорошо, прикрепленных к чашке.
Рисунок 2 Dct - / - сердечные меланоциты продемонстрировать длительное потенциала действия. Текущие записи зажим от (А) сердечной DCT +/- и (B) сердечной DCT - / - клетки демонстрируют увеличился потенциала действия в отсутствие DCT. Отдыхая потенциал DCT +/- клетки -62 мВ, в то время как Dct - / - ячейка имеет потенциал покоя-60 МВ. Воспроизводится с разрешения из Левин и соавт. J. Clin. Инвестируйте. 119, 2920-2936 (2009).
Рисунок 3 Типичные изображения изолированной (а) сердечные меланоцит-подобные клетки и (б) кожные меланоциты. Меланоциты были выделены из сердца и кожи новорожденных мышей (P1), соответственно, и затем культивировали в течение 5 дней.
Рисунок 4 Dct-экспрессирующие клетки заполнить сердце. () В гибридизация из сердца E13.5 мыши показывает выражение DCT(заполненные стрелки) вокруг легочных вен ОС (открытой стрелкой). (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание Dct-позитивных клеток (наконечники стрел) в пределах легочных вен. (С) X-Gal окрашивание DCT-положительных клеток в задней предсердие из E16.5 мыши DCT-LacZ сердца (стрелки). (D) X-гал окрашивание в E17.5 Dct-LacZ мыши сердце вдоль перегородки РА в регионах овальное отверстие, коронарного синуса ОС и нижней полой вены; вставка шкала = 500 мкм. (E) для взрослых мышь (p60) в результате скрещивания DctCre +/- и R26R мышь демонстрирует LacZ положительных клеток (стрелки) в легочных вен и левого предсердия. (F) Dct-позитивные клетки, обнаруженные иммунофлуоресцентным окрашивания (стрелки) на эндотелий хирургически удалены человека легочной вены. Масштаб = 500 мкм всех панелей, кроме панели (B и D; шкала = 100 мкм) и панель (F; = 50 мкм). Сокращения: PV, легочной вены; LA, левого предсердия; Ао, аорта; PA, пульмони капли артерии; РА, правое предсердие; IVC, нижняя полая вена; FO, овальное отверстие; CS, коронарного синуса. Воспроизводится с разрешения из Левин и соавт. J. Clin. Инвестируйте. 119, 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сердечные меланоциты находятся в анатомических местах в сердце, которые обычно приводят к мерцательной аритмии триггеров. К таким регионам относятся легочные вены, атриовентрикулярным кольцо, заднюю левого предсердия и овальное отверстие (рисунок 4). Чтобы понять роль этих клеток играть в аритмии, мы разрабатываем методы, чтобы выделить их и изучить их физиологию. Тем не менее, мы признали, что повышение эту технику, чтобы получить здоровые и большие количества сердечных меланоцитов позволит дальнейшие исследования, чтобы исследовать реакцию сердечных меланоцитов к внешним стимулам. Кроме того, улучшенные методы изоляции может также разрешить исследования исследовать взаимодействие сердечных меланоцитов с мерцательной миоцитов при нормальной физиологии и болезней.
Эта статья описывает процедуру выделения жизнеспособных меланоцитстимулирующий как клетки из сердца мыши, которую мы разработали с протоколами, направленных на изолическихели меланоцитов в коже. Важным шагом в этом протоколе является извлечение меланоцитов-подобные клетки из сердца. В то время как изоляция сердечные меланоциты от новорожденных сердца относительно прямолинейно, извлечения сердца меланоциты от зрелого сердца гораздо сложнее в связи с увеличением количества интерстициального фиброза. В этом протоколе мы использовали трипсин-переваривание, чтобы извлечь меланоциты, как клетки от зрелого сердца. Для разработки этого протокола мы протестировали несколько различных ферментативных комбинации, которые состояли из различных концентраций трипсина, коллагеназы, и диспазы.
Мы обнаружили, что лечение новорожденных предсердий с сочетанием коллагеназы (в течение первых 30 мин), после трипсина (на следующий 15 мин) первоначально производится более высокие выходы меланоцитов-подобных клеток, но изолированные клетки были менее здоровыми с снижение жизнеспособности. С другой стороны, расщепление трипсином произвел одна умеренное количество здоровых меланоцитов-клеток, как мратура мыши сердца. Поэтому, мы рекомендуем только используя трипсин изолировать меланоцитстимулирующий как клетки от зрелых мышиных сердцах. Кроме того, мы обнаружили, что энергично растирая суспензии производится после трипсином пищеварение зрелых сердцах мыши улучшили выход жизнеспособных меланоцитов-подобных клеток. Следует отметить, что трипсин имеет потенциал, чтобы частично переварить мембранные каналы или носители заряда, и это может повлиять на плотность каналов при выполнении локальной фиксации исследования. В то время как мы не провели тщательный анализ, чтобы определить, трипсин пищеварение влияет на плотность тока изолированных зрелых меланоцитов-подобных клеток мы не заметили никаких существенных последствий для токов или потенциалов действия в исследованиях проведенных нами с помощью этого протокола.
Сердечные меланоцитов-подобные клетки являются очень редкими популяция клеток в сердце (менее 0,1% всех предсердных клеток), что морфологически напоминает кожные меланоциты (рисунок 1 и рисунок 3 </ STRONG>). В связи с тем существует сравнительно мало сердечные меланоциты, присутствующие в сердце; до недавнего времени мы не только смогли использовать их для одноклеточных анализов (т.е. патч записи зажимного или одноклеточных ПЦР). Тем не менее, мы получили большие количества сердечных меланоцитов путем объединения 20-30 неонатальной или 5-8 зрелых сердца, и этот подход дает достаточное количество ткани для выполнения иммуноблот или биохимические анализы. Кроме того, принимая во внимание низкое число меланоцитов-клеток, как в мышиной сердца, для повышения выхода этих клеток после того как они были выделены мы часто размещают 15-20 мм круглой, тефлон вставки на 35-мм чашки с использованием стерильных вакуумной смазки . Клетки затем могут быть размещены внутри вставок для уменьшения площади металлизации и повышает их плотность. Использование тефлона вставляет также улучшает жизнеспособность меланоцитов-подобных клеток после их изоляции и в период покрытия, а также.
Некоторые сердечная меланоCYTE-как клетки имеют биполярную морфология следующий изоляцию, которая, по нашему мнению представляет собой менее дифференцированное состояние этих клеток. Кроме того, мы обнаружили, что культивирование сердечных меланоцитов в течение 3 дней после изоляции, кажется, чтобы вызвать дальнейшее дифференциацию меланоцитов, как фенотип, где клетки начинают формировать дендриты. Мы также обнаружили, этот протокол дает меланоцитстимулирующий как клетки от зрелых сердец, которые могут поддерживаться в течение до 10 дней в культуре. Тем не менее, за 10 дней в культуре меланоцитов-подобных клеток, выделенных из зрелых сердец остановится пролиферирующих и может стать стареющей. Изолированные сердечные и высевали меланоциты, могут быть использованы для клеточной электрофизиологического анализа или другой молекулярной клеточной / биологической анализа, такие как РНК или профилирования исследований с целью оценки их физиологические реакции на внешние факторы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет ничего раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института награждения Здоровье R01 HL105734 к VVPMDL поддерживается, в частности, Национального института исследований в области здравоохранения Карьера премии K08 HL094748. VVP является инновационный научный сотрудник Американской ассоциации сердца поддержке гранта 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
