Summary
I denne protokollen, w e identifisert en roman befolkning på melanocyte lignende celler (også kjent som hjerte melanocytter) i hjertene til mus og mennesker som bidrar til atrial arytmi utløser hos mus.
Abstract
Vi identifiserte en roman befolkning på melanocyte lignende celler (også kjent som hjerte melanocytter) i hjertene til mus og mennesker som bidrar til atrial arytmi triggere i mus. For å undersøke de elektriske og biologiske egenskaper hjerte melanocytter vi utviklet en prosedyre for å isolere dem fra mus hjerter at vi stammer fra de som er laget for å isolere neonatale muse kardiomyocytter. For å få sunnere hjerte melanocytter egnet for mer omfattende patch clamp eller biokjemiske studier, har vi utviklet en raffinert metode for isolering og plating hjerte melanocytter basert på de som opprinnelig laget for å isolere kutane melanocytter. Den raffinerte fremgangsmåten er vist i dette og gir et større antall friske melanocyte-lignende celler som kan bli belagt som en ren populasjon eller med kardiomyocytter.
Introduction
Vi har nylig identifisert en roman cellepopulasjon i hjertet av mus og mennesker som uttrykker melanin-syntese enzymer og morfologisk ligner kutane melanocytter. Vi kalte disse cellenes kardiale melanocytter 'og funnet at de er tilstede i anatomiske steder hvorfra atrial arytmi utløser ofte har sin opprinnelse i mennesker. Vi fant også hjerte melanocyttene bidra til atriearytmier i mus med germline sletting av Dct. Hjerte melanocyttene er tynt fordelt over hele musen atrium der de utgjør mindre enn 0,1% av alle atrial celler. For å undersøke de elektriske og biologiske egenskaper hjerte melanocytter vi utviklet en prosedyre for å isolere dem fra musen hjertet ved hjelp av Cre-induserbar melanocyte spesifikke markører. Vår første prosedyren ble utviklet fra de som brukes til å isolere neonatale murine cardiomyocytes og gitt meget lite antall celler egnet for patch clamp opptak eller PCR analyse. Imidlertid, for å forbedre helbredeth og levedyktighet av hjerte melanocytter, for mer dyptgående elektrofysiologisk analyse eller biokjemiske studier, har vi utviklet en raffinert prosedyren fra de som er laget for å isolere kutane melanocytter. Den fremgangsmåte som er beskrevet og vist i dette har fordelen av å produsere sunnere hjerte melanocytter som kan bli belagt som en ren populasjon eller med kardiomyocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberede de nødvendige løsninger og utstyr
- Først sterilisere kirurgiske instrumenter (rett form tang, buede formen tang, rett form saks, og buede formen saks) ved autoklavering dem for 15 min. ved 121 ° C. Forbered 2 sett med instrumenter, der ett sett brukes til å dissekere ut hjertene og det andre settet skal brukes til hakking opp vevet.
- Løs opp 1 pakke MCDB153 kultur media i 900 ml sterilisert, filtrert vann og rør sakte til pulveret er oppløst. Tilsett 1,2 g natrium-bikarbonat, eller 15,7 ml av natrium-bikarbonat-oppløsning [7,5% w / v], for hver liter sluttvolum på medium blir fremstilt og omrør inntil oppløsning. Juster pH-verdien til 7,2 ved tilsetning av enten HC1 eller 1 N NaOH, deretter helle mediet gjennom et 0,2 mikrometer filter flaskekork under sterile betingelser i en vevskultur hette (biosikkerhet skap). Samle så media og lagre den ved 4 ° C.
- Forbered kosttilskudd tillegge til kultur media (Materialer List). Kosttilskudd bør legges til media like før media er nødvendig for plating cellene.
- Forbered DPBS med 10% FBS pluss antibiotika (penicillin og streptomycin).
- Deretter klargjør en 0,25% trypsin-løsning ved å tilsette 0,25 g av trypsin (storfe bukspyttkjertelen, aktivitet> 2500 USP enheter / mg, ultrarent, USB) til 100 ml DPBS pluss antibiotika (penicillin og streptomycin).
- Annen nødvendig utstyr som trengs for å fullføre denne prosedyren inkluderer en stereo, Petri-retter (10 cm), 50 ml koniske rør, 40-mikrometer celle siler, DPBS pluss antibiotika, 60 mm-kultur retter og 35 mm kultur retter.
2. Isolere Hearts fra Neonatal Mouse Pups
- Først skaffe P0 til P2 neonatal museunger (n = 6 til 8). Det anbefales å bruke unger som genereres av avl DCT-Cre homozygote hunner med menn som er heterozygot for enten R26R: EYFP allele eller Z / EG allel å merkemelanocyte lignende celler. Både R26R: EYFP og Z / EG mus er tilgjengelig fra Jackson Laboratories (artikkelnummer 006148 og 003920, henholdsvis).
- Deretter avlive de neonatale mus unger, tørke seg på brystet med en spritserviett og deretter plassere valpene i en 10-cm petriskål med DPBS.
- Skjær huden over brystet og brystbenet med steriliserte tenger og sakser og åpne brystet nøye under en stereomikroskop. Hjertene til nyfødte mus valpene er veldig små, så vær nøye med å sørge for å fjerne hele hjertet med atriene vedlagt.
- Vask hjertene i DPBS og overføre dem til en ny 10-cm petriskål.
3. Enzymatisk Fordøyelse
- Ta med Petri-tallerken med de skåret hjerter til en vev kultur hette (biosikkerhet kabinett), og deretter følge trinnene nedenfor ved hjelp av sterile teknikker i panseret.
- Først vaske hjertene tre ganger i sterile DPBS pluss antibiotika.
- Plasser hjerter (n = 6-8) i en60-mm kultur tallerken og legg 6-8 ml av 0,5% trypsin løsning til parabolen.
- Deretter skjærer hjertene i små biter (mindre enn 1 mm i størrelse) og inkuber dem ved 37 ° C i 30 minutter i en 5% CO2 atmosfære.
- Etter inkuberingsperioden er fullført, hell den resulterende løsning av hjertevev og trypsin fra fatet i en steril 50 ml konisk rør.
- Deretter, ved bruk av en 10 ml steril pipette, hurtig, men forsiktig, finfordel-løsning i 50 ml konisk rør 30 til 50 ganger.
- Filtrer den resulterende løsning gjennom en 40-mikrometer celle sil på toppen av en ny, ren-50 ml konisk rør for å samle opp filtratet.
- Deretter Sentrifuger 50 ml rør ved 240 x g i en bordsentrifuge i 5 min ved romtemperatur. Deretter forsiktig aspirere av supernatanten og resuspender pelleten i den gjenværende 6-8 ml av sterile DPBS. Gjenta dette trinnet to ganger til. Dette trinnet pellets atrielle myocytes og hjerte melanocytter, men bringer ikke ned fibroblasts siden fibroblaster er mindre og vil forbli i supernatanten.
4. Plating Cardiac Melanocyte-lignende celler
- Etter den tredje skylling etter sentrifugering, omhyggelig renne eller suge av vaskeløsning (DPBS) og resuspender pelleten i 6 ml MCDB kulturmedier som kosttilskudd har blitt lagt til.
- Nå trekker den resuspenderte oppløsning i en steril overførings pipette og plassere cellene i en 35-mm rett, eller i en brønn i en 6-brønns plate, og bassenget på isolerte hjerteceller fra 3 neonatale mus i en 35-mm rett eller også.
- Inkuber retter over natten ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære, aspirere av kulturmediene sammen med eventuelle føyde celler og deretter skylle platene en gang med DPBS. Legg deretter frisk media til platene og erstatte media hver 2 dager. Celler isolert fra nyfødte eller embryonale hjerter kan opprettholdes på kultur i opptil tre uker, mens celler isolert fra voksen hørets kan opprettholdes i kultur for opp til 10 dager.
5. Isola Cardiac Melanocyte-lignende celler fra voksne mus Hjerte
- Først fjerner hjertene fra modne mus (3-4 uker gamle, n = 3) gjennom en midtlinjen sternotomi etter administrering heparin 100 U intraperitoneal til mus og deretter euthanizing dem. Det anbefales å bruke pentobarbital å avlive mus for denne prosedyren, men dette stoffet er ikke tilgjengelig alle steder.
- Deretter vaske skåret hjertene i sterile DPBS inneholder antibiotika i en vev kultur hette (biosikkerhet kabinett). Klem hjertene litt med buede dissecting pinsett for å fjerne eventuelle gjenværende blod fra dem og skyll hjertene i DPBS en gang til.
- Fjern atriene og atrioventrikulær ringrom fra hjerter (disse strukturene inneholder melanocyte-lignende celler) og plassere skåret vevsprøver i en 35-mm parabolen.
- Skjær hjertene i små biter ved hjelp buet saks og kraftps og deretter legge 6-8 ml av 0,5% trypsin løsning til parabolen. Deretter inkuberes rettene ved 37 ° C i 45-60 min.
- Nå, følg trinnene fra fremgangsmåten ovenfor fra trinn 3.6 og utover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen er beskrevet i denne artikkelen er en forbedret teknikk i forhold til det vi tidligere utgitt for å isolere hjerte melanocytter fra murine hjerte. Denne fremgangsmåte anvender bruken av fluorescerende markører drevet av melanin syntese enzym-spesifikke Cre-rekombinase for å merke kardiale melanocyte-lignende celler. Det er viktig å bruke en markør for å merke hjerte melanocytter når du arbeider med fersk isolerte embryonale eller neonatale celler, siden de morfologiske forskjeller som skiller hjerte melanocytter fra atrial myocytes ennå ikke har utviklet (figur 1A). Som vist i figur 1A når isoleringstrinn har gått bra, vil et ganske stort antall atrielle myocytter og kardiale melanocytter holder seg til laminin belagt form med bare noen få ikke-adherente celler. I dette tilfelle de adherente celler vises flatt på bunnen av skålen (gule pilspisser Figur 1A, pilspiss). På den annen side, når procedure ikke fungerer vel de fleste av cellene vil være ikke-tilhenger og ofte ser sfærisk og rundet opp (lys blå pilspisser, Figur 1a).
Når de isolerte cellene blir visualisert ved hjelp av grønn fluorescens avbildning, er det klart hvilke celler er kardiale melanocytter og hvilke celler er atrielle myocytter (figur 1). Som nevnt ovenfor i protokollen (trinn 3.9), blir fibroblaster fjernes fra bassenget av isolerte atrielle celler ved hjelp av sentrifugering med lav styrke som de større pellets atrielle myocytter og kardiale melanocytter, men ikke bringe ned de mindre hjerte fibroblaster. De nylig isolerte celler kan nå brukes for encellede elektrofysiologiske opptak (figur 2), enkelt celle RNA-analyse eller biokjemiske analyser.
Vi har også dyrket og vedlikeholdt isolerte nyfødte eller embryonale atrial celler ved hjelp av denne protokollen for opp til 21 dager. Ved hjelp av de dyrkningsbetingelser som beskrevet i denneprotokollen, vil hjerte melanocyte-lignende celler ytterligere differensiere og spre seg, mens de atrial myocytes en tendens til å løsne fra fatet og dø i løpet av 2-3 dager etter at de er isolert. Vist i figur 3A er sunne kardiale melanocytter 5 dager etter at de ble isolert fra et muse neonatal hjerte. Legg merke til mangelen på noen atrielle myocytter i disse cellene (i motsetning til de nylig isolerte celler er vist i figur 1). I tillegg har disse hjerte melanocytter utviklet omfattende dendrittiske prosesser og likne kutane melanocytter som også har vært i kultur i samme antall dager (figur 3B).
Figur 1. Representative (A) DIC, og (B) GFP bilder av ferskt jegsolated atrial celler fra et embryo (E19.5) DCT-Z / EG mus valp. Den hvite pilen viser hjerte melanocytter i begge panelene. Merk at uten hjelp av fluoriserende fargestoff, er den hjerte melanocyte vanskelig å identifisere og skille fra de atrial myocytes (gule pilspisser) festet til parabolen. De lyseblå pilspisser peke på atrial celler som ikke er godt festet til parabolen.
Figur 2. Dct - / - hjerte melanocyttene demonstrere forlenget aksjonspotensialer. Strømtang opptak fra (A) hjerte Dct +/- og (B) hjertestans Dct - / - celler demonstrere økt aksjonspotensialer i fravær av Dct. Hvile potensialet i Dct +/- celle er -62 mV, mens DCT - / - celle har en hvilepotensialet av-60 MV. Gjengitt med tillatelse fra Levin et al. J. Clin. Investere. 119, 2920-2936 (2009).
Figur 3. Representative bilder av isolert (A) hjerte melanocyte lignende celler og (b) kutane melanocytter. Melanocytter ble isolert fra hjertene og hud av neonatale mus (P1), henholdsvis, og deretter dyrket i 5 dager.
Figur 4. DCT-uttrykker cellene fylle hjertet. (A) In situ hybridisering av en e13.5 mus hjerte viser Dct ekspresjon(fylte piler) rundt lunge vene os (åpen pilspiss). (B) Immunofluorescent farging av DCT-positive celler (pilspisser) innenfor lungevenene. (C) X-gal farging av DCT-positive celler i bakre atrium av en e16.5 mus DCT-LacZ hjerte (piler). (D) X-gal flekker i en e17.5 DCT-LacZ mus hjerte langs RA septum i regionene i foramen ovale, koronar sinus os og vena cava inferior; innfelt skala = 500 mikrometer. (E) Voksen mus (P60) som følge av krysset en DctCre +/- og R26R mus demonstrerer LacZ positive celler (piler) i lungevenene og venstre atrium. (F) DCT-positive celler detektert ved immunofluorescerende farging (piler) på endotelet av et kirurgisk fjernet human lungevenen. Scale = 500 mikrometer i alle paneler bortsett paneler (B og D; skala = 100 pm) og panelet (F; målestokk = 50 mikrometer). Forkortelser: PV, lunge vene; LA, venstre atrium; Ao, aorta; PA, Pulmoordinært arterie; RA, høyre atrium; IVC, vena cava inferior; FO, foramen ovale; CS, koronar sinus. Gjengitt med tillatelse fra Levin et al. J. Clin. Investere. 119, 2920-2936 (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjerte melanocyttene er tilstede i anatomiske steder i hjertet som ofte gir opphav til atrial arytmi triggere. Disse områdene omfatter lungevenene, atrioventrikulær ringrom, bakre venstre atrium og foramen ovale (figur 4). For å forstå hvilken rolle disse cellene spiller i arrhythmogenesis, vi utvikler teknikker for å isolere dem og studere deres fysiologi. Men vi anerkjent som å forbedre denne teknikken til å gi sunnere og større mengder av hjerte melanocytter ville tillate videre studier for å undersøke responsen av hjerte melanocyttene til eksogene stimuli. Videre kan bedre isolasjonsteknikker også tillate studier for å undersøke samspillet av hjerte melanocytter med hjertemuskelceller under normal fysiologi og sykdom.
Dette dokumentet beskriver en fremgangsmåte for isolering av levedyktige melanocyte-lignende celler fra musen hjerte vi utviklet fra protokollene utviklet for å isolspiste melanocytter fra huden. Den kritiske trinnet i denne protokollen er utpakking av melanocyte-lignende celler fra hjertet. Mens isolere hjerte melanocytter fra neonatale hjerter er relativt rett frem, trekke hjerte melanocytter fra den modne hjerte er mye vanskeligere på grunn av den økte mengden av interstitiell fibrose. I denne protokollen brukte vi trypsin fordøyelsen å trekke melanocyte lignende celler fra den modne hjerte. For å utvikle denne protokollen vi testet flere ulike enzymatiske kombinasjoner som besto av ulike konsentrasjoner av trypsin, kollagenase, og dispase.
Vi har funnet at behandling av neonatale atria med en kombinasjon av kollagenase (for første 30 min) etterfulgt av trypsin (for de neste 15 min) opprinnelig produsert høyere utbytter av melanocyte-lignende celler, men de isolerte cellene var mindre sunn med redusert levedyktighet. På den annen side, fordøyelse med trypsin alene ga en moderat antall friske melanocyte-lignende celler fra mature mus hjerter. Derfor anbefaler vi å bruke trypsin å isolere melanocyte lignende celler fra modne murine hjerter. I tillegg fant vi at kraftig triturating slammet som produseres etter trypsin fordøyelsen av modne mus hjerter forbedret utbyttet av levedyktige melanocyte lignende celler. Vi bør nevne at trypsin har potensial til å delvis fordøye membran kanaler eller ladninger, og dette kan påvirke kanaltetthet når du utfører patch clamp studier. Mens vi ikke har foretatt en grundig analyse for å fastslå om trypsin fordøyelsen påvirker strømtetthet på isolerte, modne melanocyte-lignende celler vi ikke har merket noen betydelige effekter på strøm eller aksjonspotensialer i studiene vi har utført ved hjelp av denne protokollen.
Hjerte melanocyte-lignende celler er en meget sparsom cellepopulasjon i hjertet (mindre enn 0,1% av alle atrielle celler) som ligner morfologisk kutane melanocytter (figur 1 og figur 3 </ Strong>). Fordi det er relativt få hjerte melanocytter stede i hjertet; Inntil nylig har vi bare kunnet bruke dem for encellede analyser (dvs. patch klem opptak eller encellede PCR). Vi har imidlertid fått større mengder hjerte melanocytter ved å samle 20-30 neonatal, eller 5-8 modne hjerter, og funnet at denne tilnærmingen gir en tilstrekkelig mengde av vev for å utføre immunoblot eller biokjemiske analyser. Videre, gitt den lave antall melanocyte-lignende celler i murine hjertet, for å forbedre utbyttet av disse cellene etter at de er blitt isolert vi vil ofte sette 15-20 mm sirkulære, Teflon innsatser på 35-mm skåler sterilisert ved hjelp av vakuumfett . Cellene kan deretter bli plassert innenfor de innsatser for å redusere pletteringsområdet og øker deres densitet. Ved hjelp av Teflon setter også forbedrer levedyktigheten melanocyte lignende celler etter deres isolasjon og under plating perioden.
Noen hjerte melanocyte-lignende celler har en bipolar morfologi etter isolering, som vi mener representerer en mindre differensierte tilstand av disse cellene. I tillegg har vi funnet at dyrkning av hjerte melanocytter i 3 dager etter isolering synes å indusere ytterligere differensiering av melanocytter-lignende fenotype hvor cellene begynner å danne dendritter. Vi har også funnet denne protokollen gir melanocyte lignende celler fra modne hjerter som kan opprettholdes i inntil 10 dager i kultur. Men utover 10 dager i kultur melanocyte lignende celler isolert fra modne hjerter vil stoppe voksende og kan bli senescent. Isolerte og belagt kardiale melanocytter kan anvendes for celleelektro analyse eller annen molekylær / cellulære biologiske analyse, slik som RNA-profilering eller undersøkelser for å vurdere deres fysiologiske responser til eksogene faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health award R01 HL105734 til VVPMDL støttes delvis av National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP er en innovativ Forsker av American Heart Association støttet av tilskudd 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
