Summary
En experimentell teknik för behandling av chondral defekter i kaninens knäleden beskrivs. Implantation av autologa kondrocyter ympade på en matris är en väl accepterad metod för ombyggnad och reparation av skador ledbrosk ge tillfredsställande resultat på lång sikt. Matrix-assisterad autolog kondrocyttransplantation (MACT) erbjuder ett standardiserat och kliniskt etablerad implantation metod.
Abstract
Ledbrosk defekter anses ett stort hälsoproblem eftersom ledbrosk har en begränsad kapacitet för självregenerering 1. Obehandlade broskskador leda till pågående smärta, negativt påverka livskvaliteten och mottaglig för artros. Under de senaste årtiondena har flera kirurgiska tekniker utvecklats för att behandla sådana lesioner. Men fram tills nu var det inte möjligt att uppnå en fullständig reparation i termer av att täcka defekten med hyaline ledbrosk eller tillhandahålla tillfredsställande långsiktig återhämtning 2-4. Därför artikulära broskskador förblir ett viktigt mål för regenerativa tekniker såsom Tissue Engineering. I motsats till andra kirurgiska tekniker, som ofta leder till bildningen av fibrös eller fibrocartilaginous vävnad syftar Tissue Engineering vid fullt ut återupprätta den komplexa strukturen och egenskaperna av den ursprungliga ledbrosk genom att använda kondrogena potentialen hos transplanterade celler. Recent utvecklingen öppnat lovande möjligheter för regenerativ brosk terapier.
Den första cellen synsättet för behandling av full tjocklek brosk eller osteokondrala lesioner utfördes 1994 av Lars Peterson och Mats Brittberg som bana klinisk autolog chondrocyte implantation (ACI) 5. Idag är tekniken kliniskt väl etablerad för behandling av stora hyalinbrosk defekter i knäet, upprätthålla goda kliniska resultat och med 10 till 20 år efter implantation 6. Under senare år genomgick implantation av autologa kondrocyter en snabb progression. Användningen av en konstgjord tredimensionell kollagen-matris på vilken celler senare omplanteras blev mer och mer populär 7-9.
MACT består av två kirurgiska förfaranden: Först, för att samla in kondrocyter, behöver en brosk biopsi som skall utföras från en icke viktbärande brosk område i than knäleden. Sedan är kondrocyter extraheras, renas och utvidgas till ett tillräckligt antal celler in vitro. Kondrocyter därefter ympas på en tre-dimensionell matris och kan därefter åter implanteras. När man förbereder en vävnadstekniska implantat, proliferationshastighet och differentiering kapacitet är avgörande för en framgångsrik vävnadsregenerering 10. Användningen av en tredimensionell matris som en cell bärare tros stödja dessa cellulära egenskaper 11.
Följande protokoll kommer att sammanfatta och demonstrera en teknik för isolering av kondrocyter från brosk biopsier, deras proliferation in vitro och deras seedning på en 3D-matris (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Schweiz). Slutligen kommer implantation av de cell-matrix-konstruktioner i artificiellt skapade chondral defekter av en kanin knäled att beskrivas. Denna teknik kan användas som en experimentell inställningför ytterligare experiment av brosk reparation.
Protocol
A. Brosk biopsi (kirurgi rummet, steg 1-5 i icke-steril beredning Room)
- Utför en slutlig viktkontroll av kanin (New Zealand White rabbit, kvinnligt, 3,5-4,0 kg kroppsvikt, 6 månader gammal) för att kunna dos läkemedel på rätt sätt och att övervaka vikt efter kirurgi.
- Inducera anestesi till kaninen genom en intravenös injektion av 10 mg / kg propofol.
- Efter intubering, upprätthålla anestesi med 1,5 mg / kg / min propofol och 0,05 mg / kg fentanyl intravenöst. Övervaka anestesi med kapnografi, pulsoximetri och puls.
- Raka knäet som skall opereras med en elektrisk klippmaskin och vakuum pälsen.
- Desinficera rakade knäet ordentligt och täcka resten av kaninen med ett sterilt förband.
- Palpera knäskålen och utför en hud snitt medialt av knäskålen.
- Öppna knäleden genom en medial parapatellar artrotomi under sterila betingelser. Försök att undvika att skära av alla små superficial blodkärl.
- Förskjutning knäskålen i sidled.
- Inspektera knäleden för alla missförhållanden och makroskopiska lesioner brosk.
- Dra försiktigt små brosk bitar (2-3 mm) av den trochlea Ossis femoris med en steril skalpell (Figur 1).
- Placera omedelbart dessa brosk biopsier i ett 50 ml rör med komplett medium (DMEM + 10% fetalt kalvserum (FCS) + 1% penicillin / streptomycin (pen / strep)) för att fortsätta med in vitro-odling direkt efter operationen.
- Rengör defekter och skölj dem med steril koksaltlösning.
- Flytta knäskålen inom trochlea spåret.
- Sårtillslutning i skikt med enstaka knapp suturer (4-0 Vicryl) och en fortsatt kutan sutur (4-0 Monocryl). Använd absorberbara suturmaterial.
- Slutligen försegla såret med en spray dressing permeabel för vattenånga.
B. In vitro-kultur
- Bearbeta biopsied cartilage bitar så snart som möjligt efter operationen i en steril laminärt flöde vävnadsodling huva.
- Tvätta den sterila skördade brosk 2x i PBS med efterföljande centrifugering vid 500 x g under 3 min vid rumstemperatur.
- Skär brosk i stycken på 1 mm 3, överför till en 50 ml Falcon och smälta dem på en skak under 30 min med 10 ml trypsin-EDTA (0,25%) och 10 ml PBS under 30 min
- Efter 30 minuter, stoppa trypsinization genom att lägga till komplett medium. Sedan, skaka brosk stycken för en annan för 12 timmar med kollagenas A (0,21 U / mg) i serumfritt medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Centrifugera den erhållna lösningen vid 170 xg under 3 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera cell pellets i 5 ml komplett medium.
- Seed de isolerade kondrocyter på till 25 cm 2 vävnadsodlingskolvar i 5 ml komplett medium och hålla i en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
- Odla kondrocyter till en densitet av 80%.
- Släpp celler from kolvar genom tvättning i PBS 2x innan exponering till 0,05% trypsin-EDTA under 3 min. När kondrocyterna loss, stoppa trypsinisering genom tillsats av 10 pl komplett medium.
- Centrifugera suspensionen vid 300 xg (3 min) och återsuspendera pelleten i komplett medium.
- Seed celler i vävnadsodlingskolvar (75 cm 2) och delade på en 1:3 (~ 5000 celler / cm 2) var 5: e dag eller efter 80% sammanflöde.
- Bestäm cellantal och livskraft genom trypanblå färgning.
C. cellsådd av Matrix
- Före implantationen tvätta och celler frisättning såsom beskrivits ovan. Utför celltal och överföra 5 x 10 4 celler i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Sedan centrifugera vid 500 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera pelleten i 15 | il fullständigt medium för en fullständig mättnad av matrisen.
- Skär dubbellagret kollagen byggnadsställning till de exakta mått trochlear defekten med en steril biopsipunch.
- Placera matrisen in en lämpligt dimensionerad vävnadsodlingsskål (t.ex. 24-brunnsplattor).
- Seed celler på den porösa, cell-adhesiva sidan av matrisen. Detta avskräcker cellmigration bort från matrisen.
- Lämna cell-seeded matriser utan ytterligare cellodlingsmedium inom en inkubator under 1 timme för att tillåta fullständig vidhäftning av kondrocyter.
- Därefter placerar cell-matrix-konstruktioner i odling behållare (t.ex. 24 brunnar) med färskt komplett medium. Se till att inte tvätta ur eventuella celler utanför matrisen trots stark vidhäftning förväntas.
- Nu kan cell-matrix-konstruktioner tas till operation utrymme för re-implantation.
D. Matrix-assisterad Autologous kondrocyttransplantation
- Utför parapatellar artrotomi till den kontralaterala knäet som beskrivits ovan (A. 1-8).
- Skapa två isolerade chondral defekter i troklearfåran med en steril luft operating borrmaskin (3,6 mm i diameter).
- Rengör defekten och skölj med steril saltlösning.
- Uppmärksamhet bör ägnas inte öppna märgen hålighet som helst. Vid behov, täta botten av defekter med elektrisk BRÄNNJÄRN mot blödningar.
- Implantera matriserna ympade med de odlade kondrocyterna med porösa nedåt (Figur 2). Tryck sedan på-plats i borrhålen och spola den omgivande ytan.
- Täta de implanterade matriserna med en liten bit av fibrinlim (Tissucol Duo S) för att garantera en säker fixering.
- Efter koagulering, flytta knäskålen inom troklearfåran och tillämpa fullt rörelseomfång i knäleden några gånger.
- Förskjutning knäskålen i sidled igen och kontrollera om någon händelse eller tecken på instabil fixering. Matriserna måste hållas kvar.
- Byt knäskålen igen och avsluta operationen med sårtillslutning i skikt och spray dressing såsom beskrivits ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna kirurgiska tekniken tillåter en lyckad isolering och implantation av autologa kondrocyter i en konstgjord kondral defekt. Den experimentuppställning resulterade i en framgångsrik integration av implantatet i den omgivande brosk.
Efter 12 veckor in vivo, var kondral defekten fylls genom reparation vävnad med en homogen och intakt yta, vilket minskar skjuvspänning och skador på implantatet (Figur 4). Det var inte heller hypertrofi eller förkalkning av implantatet sett. Reparationen vävnaden uppvisade en stel och fast kvalitet, vilket var jämförbart med den friska omgivande broskvävnad. Detta var en viktig aspekt eftersom en ökad belastning på den intilliggande brosk på grund av otillräckliga biomekaniska egenskaperna hos implantatet skulle vara en risk för tidig degeneration. Dessutom har ett transplantat delaminering skett inte. Efter att ha klippa membranet till samma storlek av defekten preoperativt, någon fissuring eller klyftor mellan implantatet och omgivande brosk undveks.
Figur 1. Monolayer av kondrocyter primär kultur vid 80% sammanflöde.
Figur 2. Tar en brosk biopsi av den femorala trochlea spåret.
Figur 3. Artificiellt skapade trochlear broskdefekten.
Figur 4. Öppnade knäleden 12 veckor efter implantation av ett membran ympades med autologa kondrocyter i en pre-Borrade kondral defekt (röd pil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade protokollet ger en etablerad 9,12,13 och enkelt reproducerbar teknik för att isolera autologa kondrocyter för efterföljande spridning och re-implantation i artificiellt skapade broskdefekter i kanin knä. Användningen av autologa kondrocyter för ombyggnad och reparation av skador ledbrosk är redan i kliniskt bruk som ger tillfredsställande resultat på lång sikt 6.
Stora problem som till exempel periostal hypertrofi och förkalkning, graft delaminering eller tagstället sjuklighet inträffade med första och andra generationen av autolog chondrocyte implantation 14. Därför har forskare utvecklat metoder med exogena bioresorberbara material för att leverera kondrocytema till det defekta stället. Den positiva effekten av tredimensionellt odlingssystem på underhåll av chondrocytic egenskaper har vid upprepade tillfällen visat, t.ex. vid användning av agaros 15, Poly - dioxanon och polyglaktin 16, polyestrar poly (L-laktid) (PLLA) och poly (D, L-laktid-glykolid) (PLGA) 17, fibrin 12, hyaluronan 18, alginat 19, kollagen 20 eller kollagen-matriser 9 .
Dubbelskiktet kollagenmembran Chondro-Gide används i denna studie har tillämpats framgångsrikt i flera prekliniska studier före 9,21,22 och ingår redan i kliniska tillämpningar 21,23. Dubbelskiktet struktur kollagenmembranet erbjuder en stabil mikromiljö för kondrocyt integration och proliferation, möjliggör en jämn fördelning av cellerna inom matrisen och eliminerar risken för cellen läckage eftersom det ses i konventionell ACI 11. Genom användning av denna MACT tekniken är transplanterade kondrocyterna lokalt bevaras med bibehållen lönsamhet. Matris-assisterad autolog kondrocyttransplantation leder till syntes avbroskliknande förnyelse vävnad och är kliniskt tillämplig 21.
Den beskrivna djurmodell är väl accepterat i experimentell behandling av lesioner ledbrosk 11,24,25. Emellertid är översättningen till klinisk rutin av eventuella resultat från försök med användning den presenterade tekniken svårt av flera skäl. I en djurmodell är det nästan omöjligt att uppnå icke eller delvis viktbärande under de första dagar / veckor efter operationen som skulle allmänt rekommenderade att tillåta de implanterade cellerna att börja med tidiga integrationsprocesser. Full viktbelastning direkt efter operationen kan potentiellt skada transplantationen och därmed kan påverka resultatet. Men denna inställning var liknande i alla djurmodeller jämförbara 9,12. Experiment med större djur, närmare liknar den mänskliga situationen, är motiverat att ytterligare djurstudier.
Sammanfattningsvis är emellertid en etablerad experimental djurmodell som den beskrivs ovan ger en grund för fortsatta experimentella studier av brosk reparation och kan även underlätta förverkligandet och genomförandet av komplexa studie inställningar. Experimentella undersökningar med tillväxtfaktorer, geninduktion och ändra egenskaper matris med denna djurmodell kan vara till hjälp för att förbättra de etablerade kliniska inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta projekt har finansierats av det tyska Research Association (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
