彗星试验是检测单和双链断裂,包括碱不稳定的的网站和DNA-DNA/DNA-protein交联在所有细胞中的DNA,包括海马神经元的一种有效方式。由于DNA损伤的量的差异,在电场中的方法,利用差DNA迁移。
一些药物的目标是DNA修复途径,通过建立DNA损伤诱导细胞死亡。因此,直接测量DNA损伤的进程已经得到了广泛的评估。传统的方法是费时的,昂贵的,资源密集型的时间,需要复制的细胞。与此相反,彗星试验,单细胞凝胶电泳法,是更快的,非侵入性,价格低廉,直接和敏感的DNA损伤和修复措施。所有形式的DNA损伤以及DNA修复可以使用这个强大的技术在单细胞水平的可视化。
彗星试验的原则是高度有序的,完整的DNA,而DNA损伤,破坏了这种组织。受损的DNA的琼脂糖基质渗入和电场进行时,带负电荷的DNA是带正电的向阴极迁移。大的未损坏的DNA链是不能够迁移远离原子核。 DNA损伤创建更小的DNA片段更远较完整的DNA。彗星试验检测,图像分析软件,措施和比较的整体在细胞核中的DNA的荧光强度与已迁移出细胞核的DNA。从迁移的DNA的荧光信号是正比于DNA损伤。更长的明亮的DNA尾着增加DNA损伤。某些测量的参数,该参数是尾矩,它是衡量两者的DNA的量和分布在尾部,尾部长度的DNA和DNA的百分比在尾部。此法可以测量DNA修复以及修复已经发生DNA损伤的决议表示。灵敏度的极限是约50的链断裂每二倍体哺乳动物细胞1,2。与任何DNA损伤剂,如鬼臼乙叉甙处理的细胞,也可以使用作为阳性对照。因此,彗星试验是一种快速,有效的方法来衡量DNA损伤。
彗星试验分析单个细胞具有独特的能力。这是有利的鉴定表明微分响应的细胞毒性剂的细胞亚群。一个必须考虑一些实际的限制。的细胞数,可以单独评估,可能会有所不同,这取决于个人。样本大小需要增加内的人口在DNA损伤,如果有方差。可行的单细胞悬液,此测定是至关重要的,因为优势坏死或凋亡的细胞的存在下,将加至错误。的细胞凋亡,小的DNA片段(小于50KB),线粒体DNA的裂解和电…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持的,战斗的儿童癌症基金会,阿拉巴马州伯明翰大学综合癌症中心的放射肿瘤学,Gabrielle的天使基金(ESY。)系的影响力大奖。
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
Agarose | Sigma | A5093 | |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
EDTA | GIBCO | 15575 | |
Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
Microwave | Sears | ||
Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
Power supply | BioRad | 1645050 | |
Refrigerator | Sears | ||
Ruler | Staples | ||
Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
Tris Base | Sigma | T6066 | |
Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |