Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay
Summary
Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.
Abstract
Eine Reihe von Medikamenten gezielt die DNA Reparaturmechanismen und induzieren Zelle, indem sie DNA-Schäden zu töten. So wurden Prozesse direkt zu messen DNA-Schäden wurde ausgiebig evaluiert. Herkömmliche Methoden sind zeitaufwendig, teuer und erfordern ressourcenintensiv replizierende Zellen. Im Gegensatz dazu ist die Comet-Assay, eine einzelne Zelle Gelelektrophorese-Assay, ein schneller, nicht-invasiven, kostengünstigen, direkt und empfindliches Maß von DNA-Schäden und Reparatur. Alle Formen von DNA-Schäden sowie DNA-Reparatur kann an der einzelnen Zelle mit diesem leistungsstarken Technik visualisiert werden.
Das Prinzip des Comet Assay ist, dass intakte DNA ist hoch geordnete wohingegen DNA Schädigung unterbricht diese Organisation. Die beschädigten DNA sickert in der Agarose-Matrix und, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wandert der negativ geladenen DNA zur Kathode, das positiv geladen ist. Die großen unbeschädigten DNA-Stränge sind nicht in der Lage zu weit vom Kern migrieren. DNA-Schädenentstehen kleinere DNA-Fragmente, die weiter als die intakte DNA reisen. Kometentest eine Bildanalyse-Software, misst und vergleicht die gesamte Fluoreszenzintensität der DNA im Zellkern mit DNA, die aus dem Nukleus migriert ist. Fluoreszenzsignal aus der migrierten DNA ist proportional zur DNA-Schäden. Längere heller DNA tail bedeutet erhöhte DNA-Schäden. Einige der Parameter, die gemessen werden Leitwerksmoment die ein Maß für sowohl der Menge an DNA und Verteilung der DNA im Schwanz, Schwanzlänge und Prozentsatz der DNA in dem Endstück ist. Dieser Test ermöglicht es, DNA-Reparatur als auch messen, da Auflösung von DNA-Schäden bezeichnet Reparatur stattgefunden hat. Die Grenze der Empfindlichkeit liegt bei etwa 50 Strangbrüche pro diploid Säugetierzellen 1,2. Zellen mit irgendwelchen DNA-schädigende Mittel, wie zum Beispiel Etoposid behandelt wird, kann als eine positive Kontrolle verwendet werden. So ist die Comet-Assay ist eine schnelle und wirksame Verfahren, um DNA-Schäden zu messen.
Protocol
Discussion
Der Comet Assay hat die einzigartige Fähigkeit zur Analyse von einzelnen Zellen. Dies ist vorteilhaft bei der Identifizierung von Subpopulationen von Zellen, die differenzielle Reaktion auf zytotoxischen Mitteln demonstrieren. Einige praktische Einschränkungen zu berücksichtigen. Die Anzahl der Zellen, die einzeln ausgewertet werden kann je nach dem Individuum. Der Stichprobenumfang erhöht werden muss, wenn es Varianz in DNA-Schädigung innerhalb einer Population. Lebensfähigen Einzelzell-Suspension ist für diesen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der IMPACT Award vom Department of Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, The Fighting Kinderkrebsstiftung und der Gabrielle 's Angel Foundation (zum ESY.) Unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
