Summary

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

Published: December 19, 2012
doi:

Summary

Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.

Abstract

Eine Reihe von Medikamenten gezielt die DNA Reparaturmechanismen und induzieren Zelle, indem sie DNA-Schäden zu töten. So wurden Prozesse direkt zu messen DNA-Schäden wurde ausgiebig evaluiert. Herkömmliche Methoden sind zeitaufwendig, teuer und erfordern ressourcenintensiv replizierende Zellen. Im Gegensatz dazu ist die Comet-Assay, eine einzelne Zelle Gelelektrophorese-Assay, ein schneller, nicht-invasiven, kostengünstigen, direkt und empfindliches Maß von DNA-Schäden und Reparatur. Alle Formen von DNA-Schäden sowie DNA-Reparatur kann an der einzelnen Zelle mit diesem leistungsstarken Technik visualisiert werden.

Das Prinzip des Comet Assay ist, dass intakte DNA ist hoch geordnete wohingegen DNA Schädigung unterbricht diese Organisation. Die beschädigten DNA sickert in der Agarose-Matrix und, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wandert der negativ geladenen DNA zur Kathode, das positiv geladen ist. Die großen unbeschädigten DNA-Stränge sind nicht in der Lage zu weit vom Kern migrieren. DNA-Schädenentstehen kleinere DNA-Fragmente, die weiter als die intakte DNA reisen. Kometentest eine Bildanalyse-Software, misst und vergleicht die gesamte Fluoreszenzintensität der DNA im Zellkern mit DNA, die aus dem Nukleus migriert ist. Fluoreszenzsignal aus der migrierten DNA ist proportional zur DNA-Schäden. Längere heller DNA tail bedeutet erhöhte DNA-Schäden. Einige der Parameter, die gemessen werden Leitwerksmoment die ein Maß für sowohl der Menge an DNA und Verteilung der DNA im Schwanz, Schwanzlänge und Prozentsatz der DNA in dem Endstück ist. Dieser Test ermöglicht es, DNA-Reparatur als auch messen, da Auflösung von DNA-Schäden bezeichnet Reparatur stattgefunden hat. Die Grenze der Empfindlichkeit liegt bei etwa 50 Strangbrüche pro diploid Säugetierzellen 1,2. Zellen mit irgendwelchen DNA-schädigende Mittel, wie zum Beispiel Etoposid behandelt wird, kann als eine positive Kontrolle verwendet werden. So ist die Comet-Assay ist eine schnelle und wirksame Verfahren, um DNA-Schäden zu messen.

Protocol

Ein. Cell Culture Kultur neuronalen Zellen und behandeln Sie sie nach Bedarf. Ernte Zellen in 15 ml Röhrchen: Aspirat Medien, mit Phosphat spülen Kochsalzlösung (PBS, Calcium und Magnesium befreit), fügen Trypsin, sammeln sich in 15 ml Röhrchen und neutralisieren Trypsin mit geeigneten serumhaltigen Medien. Spin bei 1.000 xg für 5 min. Absaugen Medien. Die Zellen in PBS. Spin bei 1.000 xg für 5 min. Absaugen Medien und resuspendieren Zellen in…

Discussion

Der Comet Assay hat die einzigartige Fähigkeit zur Analyse von einzelnen Zellen. Dies ist vorteilhaft bei der Identifizierung von Subpopulationen von Zellen, die differenzielle Reaktion auf zytotoxischen Mitteln demonstrieren. Einige praktische Einschränkungen zu berücksichtigen. Die Anzahl der Zellen, die einzeln ausgewertet werden kann je nach dem Individuum. Der Stichprobenumfang erhöht werden muss, wenn es Varianz in DNA-Schädigung innerhalb einer Population. Lebensfähigen Einzelzell-Suspension ist für diesen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der IMPACT Award vom Department of Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, The Fighting Kinderkrebsstiftung und der Gabrielle 's Angel Foundation (zum ESY.) Unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
1.5 ml tubes Santa Cruz Biotechnology, Inc Sc-200271
10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) Fisher Scientific BP13331
15 ml tube Fisher Scientific 0553851
Agarose Sigma A5093
Aluminum foil Fisher Scientific 01213101
Beaker Fisher Scientific FB102300
Centrifuge Thermo Scientific 75004261PR
Comet Assay software Comet Assay IV Image Analysis System
Cylinder Fisher Scientific 08555F
EDTA GIBCO 15575
Electrophoresis chamber Thermo Scientific 09528101
Ethanol Fisher Scientific A407P4
Fluorescent microscope Zeiss Axio Vision Any fluorescent microscope with green filter will suffice
Hemacytometer Fisher Scientific 0267152
Low melting point agarose Promega V2111
Microwave Sears
Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free HyClone SH3025601
Power supply BioRad 1645050
Refrigerator Sears
Ruler Staples
Slide Fisher Scientific 12550143
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium hydroxide Sigma S5881
Sodium lauryl sarcosinate Fisher Scientific S529
Sybr green Invitrogen S7585
Tray Fisher Scientific 15242B
Tris Base Sigma T6066
Triton-X 100 Sigma T8787
Trypsin HyClone SH3023601
Vortex Fisher Scientific 02216108
Water bath Fisher Scientific 154622Q

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Cite This Article
Nowsheen, S., Xia, F., Yang, E. S. Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay. J. Vis. Exp. (70), e50049, doi:10.3791/50049 (2012).

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