Summary
En fremgangsmåde til at analysere opløsningsmidlet adgang til thiolgruppen af cysteinrester af
Abstract
Efterligning og udnytte virus egenskaber og fysisk-kemiske og fysiske egenskaber besidder løfte om at levere løsninger til nogle af verdens mest presserende udfordringer. Alene rækkevidde og virustyper kombineret med deres spændende egenskaber potentielt give uendelige muligheder for ansøgninger i virus-baserede teknologier. Vira har evnen til at selv-samle til partikler med diskrete form og størrelse, specificitet symmetri, alsidighed og stabile egenskaber under et bredt område af temperatur-og pH-betingelser. Ikke overraskende med sådan en bemærkelsesværdig vifte af egenskaber, er virus foreslået til anvendelse i biomaterialer 9, vacciner 14, 15, elektroniske materialer, kemiske værktøjer og molekylær elektronisk beholdere 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
For at udnytte virus inden for nanoteknologi, skal de ændres fra deres naturlige former for at give nye funktioner. Denne udfordrende process kan udføres gennem flere mekanismer, herunder genetisk modifikation af det virale genom og kemisk fastgørelse af fremmede eller ønskede molekyler til viruspartiklen reaktive grupper 8. Evnen til at ændre en virus primært afhænger af de fysisk-kemiske og fysiske egenskaber af viruset. Desuden skal de genetiske eller fysisk-modifikationer, der skal udføres uden at påvirke den virus native struktur og virus-funktion. Majs rayado fino virus (MRFV) kappeproteiner selv samle i Escherichia coli, der producerer stabile og tomme VLP'er, der er stabiliseret med protein-protein interaktioner og som kan anvendes i virus-baserede teknologier applikationer 8. VLP'er produceret i tobaksplanter blev undersøgt som et stillads, på hvilken forskellige peptider kan være kovalent vises 13. Her beskriver vi trinene til 1) bestemme, hvilken af de opløsningsmiddel-tilgængelige cysteiner i en virus capsid fås til modifikation, og 2) Bioconjugate peptider til de modificerede capsider. Ved anvendelse af native eller mutation-indsat aminosyrerester og standard koblingsmidler teknologi, har en bred vifte af materialer er vist på overfladen af plantevirus, såsom Brome mosaikvirus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotisk skjoldet virussatellit 6, tobak mosaik virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1 og MRFV 13.
Protocol
1. Virus Inokulation og VLP'er Oprensning fra Nicotiana benthamiana Planter
- Fremstille udjævnet T7-RNA-transkripter fra kartoffel-virus X (PVX)-baseret vektor plasmider, der bærer MRFV vildtype (wt) og Cys-muterede kappeprotein (CP) generne 12, ved hjælp af Ambion s T7-mMessage mMachine Kit.
- For hver T7 transcript reaktion, podes to fuldstændigt udfoldede blade af N. benthamiana med 10 gl reaktioner og inkuberes planterne i 10 dage i drivhus ved 60% fugtighed i 16 timer med lys (25.000-30.000 lux) ved 25 ° C og 8 timers mørke ved 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana virus-inficerede blade 10 dage efter inokulering (dpi) vejes plantevævet (50 gram) og sted på is.
- Homogenisere plantematerialet i en blender i nærvær af 100 ml af en afkølet opløsning af 0,5 M Na-citratbuffer, pH 5,5 (brug 2 ml buffer per gram plantevæv).
- Filtreres homogenat gennem 3 lag cheeseclOTH og tydeliggøre ved centrifugering ved 27.000 x g i 30 min. Overfør supernatanten til et afkølet måleglas, måle volumen, og derefter overføre til en kølet steril bæger. Kasseres pellet.
- Behandle supernatanten ved tilsætning af 10% polyethylenglycol 8000 (PEG 8000), omrøres i 15 minutter ved 4 ° C, og inkuberes i yderligere 45 minutter ved 4 ° C for at udfælde de viruslignende partikler (VLP'er)-PEG matrix.
- Centrifuger prøven ved 27.000 x g i 20 min ved 4 ° C og fjern supernatanten.
- Behandle pelleten ved tilsætning af 8 ml 0,05 M Na-citratbuffer, pH 5,5 indeholdende 2% Triton X-100. Swirl det centrifugeglas og at frigøre pillen. Overfør pelleten og puffer til en afkølet sterilt bægerglas. Skyl rørene straks med 2 ml af den samme buffer og føje til bægerglasset. Suspensionen omrøres ved 4 ° C indtil de pellets opløses (generelt 1 time).
- Tydeliggøre ved centrifugering i 5 minutter ved 27.000 x g, kasseres pelleten, og pprocesmodeller supernatanten ved centrifugering ved 140.000 x g i 2 timer ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes i 1 ml 0,05 M Na-citratbuffer, pH 5,5 og anbringes suspensionen oven på en 10-40% sucrosegradient fremstillet i 0,05 M Na-citratbuffer, pH 5,5.
- Centrifugeres gradient i 3 timer ved 140.000 x g ved 4 ° C.
- Kaste lys over toppen af centrifugerøret og opsamle lys-spredning øvre bånd ved 4 cm fra toppen af røret, fortyndes med 0,05 M Na-citratbuffer, pH 5,5, og centrifugeres i 3 timer ved 140.000 x g ved 4 ° C.
- Pelleten genopslæmmes i 0,5 ml sterilt vand og opbevares ved 4 ° C i op til seks måneder.
- Kvantificere VLP'erne koncentration ved at udføre et Bradford-proteinassay. Udbyttet af VLP'er er mellem 1 og 3 ug / g plantevæv.
2. Fluorescein-5-maleimid-mærkning reaktioner VLP'er
- Der fremstilles en 1 mM opløsning af fluorescein-5-maleimid (427,37 g / mol) i 50 mM natrium-Phosphate-puffer, pH 7,0, 1 mM EDTA. Bland bruge vortex og kontrollere fuldstændig opløsning. Beskytte røret mod lys med aluminiumsfolie.
- Tilføj fluorescein-5-maleimid til VLP'er fremstillet i trin 1, og der blandes. Anvend en 25-gange molært overskud af fluorescein-5-maleimid til molær mængde af sulfhydryler. Generelt under anvendelse af 30 fil af VLP'er i en koncentration på 1 pg / pi og 60 ul af fluorescein-5-maleimid opløsning frembringer acceptable resultater.
- Inkubere reaktionsblandingen i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Afslutte reaktionen ved tilsætning af dithiothreitol (DTT) til en slutkoncentration på 50 mM.
- Fjerne ikke-omsatte fluorescein anvendelse af en afsaltning spinkolonne (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) og centrifugering i 2 minutter ved 1.500 x g ved stuetemperatur.
- For SDS-PAGE analyse, tilsættes 10 pi 2 x SDS-PAGE Laemmli-prøvebuffer til 10 gl af hver reaktion. Gemme det mærkede protein beskyttet mod lys ved 4 ° C i op til en måned elleri engangsmaterialer prøver ved -20 ° C op til 3 måneder.
3. Mærkning Reaktion og Bestemmelse af Biotin Incorporation
- Brug afsaltning spin-søjler (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) for at udføre en bufferudskiftning fra vand til phosphatpufret saltopløsning (PBS), pH 7,0 af VLP'er fremstillet i trin 1.
- Der fremstilles en 20 mM stamopløsning af maleimid-PEG2-biotin ved tilsætning af 190 ul PBS i No-afvejes maleimid-PEG2-biotin og blandes ved pipettering op og ned.
- Tilføj maleimid-PEG2-biotin til VLP'erne og bland. Anvende et 10 gange molært overskud af reagens til VLP'er opløsninger ≤ 2 mg / ml.
- Inkuber reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 4 timer.
- Fjerne ikke-omsat maleimid-PEG2-biotin under anvendelse af en afsaltningskolonne spinkolonne (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) og centrifugering i 2 minutter ved 1.500 x g ved stuetemperatur.
- Bestemme mol biotin pr mol VLP'er under anvendelse af Pierce Biotin Kvantificering Kit (Thermo Scientific) og following producentens anvisninger.
4. Tværbinding af Cys 2-VLP'er og F Peptid
- VLP'er, som resulterede i tilgængelige cysteinrester til tværbinding i trin 2 (Cys 2-VLP) anvendes i det følgende trin. Der fremstilles en frisk tværbinding stamopløsning (28,63 mM) ved at opløse 10 mg NHS-PEG4-maleimid tværbindingsmiddel i 680 pi af dimethylsulfoxid.
- Opløse en 17 (F)-aminosyre langt peptid (LLPNMOKDKEACAKAPL) i 50 pi konjugering puffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) ved en koncentration på 0,1 mM.
- Tilsættes 4 pi af krydsbinder til 50 ul af opløst peptid (protein-NH2) ved 1 mM slutkoncentration (som er et 10 gange molært overskud til 0,1 mM peptidopløsning).
- Inkubere reaktionsblandingen i 2 timer ved 4 ° C.
- Purify tværbundet peptid ved anvendelse af en afsaltningskolonne (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) ækvilibreret med konjugation puffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) ved centrifugering ved 1500 x gi 1 min ved stuetemperatur.
- Opsætning af en reaktionsblanding at kombinere VLP'er (protein-SH) og tværbundet peptid (protein-NH2) i et molforhold bestemmes af antallet af thioler og aktiverede aminer er involveret i reaktionen, og forskellen i molekylvægt mellem VLP'er og peptid.
- Inkubere reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 2 timer ved 4 ° C.
- Til Western blot-analyse, blandes det resulterende konjugerede produkt 1:1 med Laemmli-buffer, koges i 10 minutter, og fortsætte med SDS-PAGE på en forstøbt 10-20% Tris-Glycin gel (Invitrogen), efterfulgt af elektroblotting på en nitrocellulosemembran (Invitrogen). Blokere membranerne med 1 x PBS, pH 7,2 indeholdende 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) og 5% skummetmælkspulver og probe med peptid-specifikke antistoffer efterfulgt af passende phosphatase-mærket sekundært antistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forbigående ekspression af mutant MRFV coat protein (CP) gener i N. benthamiana planter i en PVX-baserede vektor producerende VLP'er er beskrevet i figur 1.. Den modificerede MRFV kappeproteingen er amplificeret ved PCR og derefter placeret under transkriptionel kontrol af den duplikerede subgenomiske CP promotoren i en PVX-baseret vektor, pP2C2S 2 (en gave fra D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, England). I vitro RNA-transkription producerer RNA-transkripter, der derefter bruges til at inokulere N. benthamiana planter. I de inficerede planter (figur 2A) MRFV-CP-underenheder danner VLP'er (figur 2B), der let oprenses. Efterfølgende VLP'er tværbundet til peptider.
Et eksempel på reaktive aminosyrer af MRFV coat protein er vist i figur 3.. Hver aminosyre valgt syre kan anvendes til fastgørelse af dele, hvis det er overfladeeksponerede. Den chemical teknikker indbefatter traditionelle bioconjugation strategier såsom, for acylering af aminogruppen i lysin, alkylering af sulfhydrilic gruppe af cystein og aktivering af carboxylsyrerester og kobling med tilsatte aminer. Desuden kan de aromatiske grupper af tyrosin og tryptophan være attraktive mål for bioconjugation ved diazotering og alkylering.
Opløsningsmidlet tilgængelighed af Cys-rester af VLP'er til thiol-specifikke reagenser er illustreret i figur 4. Oprenset wt-VLP'er (bane 4) og Cys-VLP'er mutanter bærer cysteinrester i position 107 til 111 (bane 1) og 192-194 (bane 3) af CP-gen 12 er ikke-reaktive i native betingelser med thiol-reagens (fravær af fluorescens). Fluorescein-5-maleimid bibringer orange fluorescens kun for de Cys-VLP'er mutante transporterer cysteinrester i position 125-129 af CP-genet (bane 2). Resultatet viser, at VLP'er i bane 2 har en geometrisk arrantrædelse af cysteiner restprodukter i opløsningsmiddel-eksponerede frie thiolgrupper, mens cysteinresterne i prøverne i bane 1 og 3 måske er involveret i disulfidbroer i foldningen af kappeproteinet.
Mærkningsprodukter reaktioner med maleimid-PEG2-biotin efterfulgt af en biotinylering assay repræsenterer endnu et eksempel på analyse af opløsningsmiddel adgang til Cys-rester. Fordi biotin er et relativt lille molekyle, kan det konjugeres i flere eksemplarer på VLP'er, som hver især kan binde et molekyle af avidin som i figur 5 viste. Niveauet af biotinylering, 84,74 mol biotin pr mol protein 13 angiver antallet af biotinmolekyler bundet til VLP'er, og dermed antallet af ligander, der kan vises på den ydre overflade. På grund af tilstedeværelsen af flere thiolgrupper på VLP'erne kan peptider fastgøres ved tværbindingsreaktioner med NHS-PEG4-maleimid. Dette reagens er en han Tero-bifunktionelt tværbindingsmiddel, som indeholder reaktive ender, såsom N-hydroxysuccinimid (NHS)-ester-og maleimidgrupper, hvilket tillader kovalent konjugering af amin-og sulfhydrylholdige molekyler. Som vist i figur 6A, at NHS esteren reagerer med primære aminer danner amidbindinger, mens maleimid reagerer med sulfhydrylgrupper danner stabile thioetherbindinger. Tværbindingsreaktioner producere VLP'er-peptidkomplekser, der er immunreaktive med de specifikke antistoffer i Western blot som vist i figur 6B.
Fig. 1. Skematisk diagram af produktionen af VLP'er i planter, efterfulgt af VLP'er oprensning og efterfølgende tværbinding af peptiderne.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 2. Symptomer, fremkaldt af T7-transkripter inokulering på N. benthamiana planter (A) og transmissionselektronmikroskopi af de fremstillede VLP'er (B).
Figur 3. En proteinstruktur forudsigelse af vildtype (wt)-MRFV-CP viser reaktive cystein aminosyrer (angivet med pile).
Fig. 4. SDS-PAGE-analyse af oprensede VLP'er konjugeret til fluoroscein-5-maleimid. (A) Simply blåt sikker farvning blev anvendt til at farve proteiner. (B) Fluorescein-5-maleimid påvisning ved fotografering under UV belysning. M: forud farvede bred vifte proteinmarkør (Bio-Rad, Hercules, CA), 1: oprenset Cys 1-VLP'er, 2: renset Cys 2-VLP'er, 3: renset Cys 3-VLP'er, 4: oprensede wt VLP'er. (Cys 1-VLP'er, Cys 2-VLP'er og Cys 3-VLP'er er Cys-MRFV-VLP'er mutanter 13).
Figur 5. AT = 3 bånd model af isometriske VLP'er der viser den sulfhydrylreaktive kemi til (A) biotinmærkning og (B) fluorescein-5-maleimid mærkning.
Fig. 6. Diagram, som viser proteintværbinding mellem Cys 2-VLP'er og F-peptid (A) og Western blot (B) for Cys-VLP'er-F probet med specifikke antistoffer mod F-peptid. M: forud farvede bred vifte proteinmarkør (Bio-Rad, Hercules, CA), 1:. Cys-VLP-F produceret i trin 4 Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåden præsenteres her muliggør en meget følsom og hurtig analyse af reaktive cysteiner er til stede på overfladen af plante-produceret VLP'er samt andre protein-komplekser. Maleimider er thiol-specifikke reagenser, som reagerer med frie sulfhydrylholdige molekyler til dannelse af stabile thioetherbindinger. Denne metode bygger på specificitet maleimider til at reagere med sulfhydrylgrupper ikke er involveret i samspillet med andre aminosyrer. Bevarer den native struktur af VLP'erne er meget vigtigt gennem hele processen. I den beskrevne anvendelse, udføres reaktionerne i native betingelser og ved pH 7 for at opretholde den native struktur VLP'er. Ved neutral pH, har maleimider optimal reaktivitet med frie sulfhydrylgrupper. Dette tillader mærkning af VLP'erne med enten fluorescein eller biotin til cystein tilgængeligt for ændringer.
Mild pH (6,5-7,5) og bufferbetingelser også anvendes i tværbindingenreaktioner. Antallet af funktionelle grupper på VLP'erne bestemmer det passende forhold mellem tværbinder og VLP'er. Lower tværbinder til protein-forhold kan anvendes i tilfælde, hvor der er mange funktionelle grupper. Omvendt er en højere krydsbinder til protein-forhold anvendes med færre tilgængelige funktionelle grupper.
En vifte af faktorer, herunder space arm, spaltning, kemisk sammensætning, dimensioner, og opløseligheden sidste ende bestemme valget af anvendte tværbindere. Endvidere er valget af den anvendte tværbinder også en funktion af størrelsen af de to proteiner (i dette tilfælde VLP'er og peptid) involveret i konjugeringen. Hetero-bifunktionelle tværbindere er ideelle til protein-peptid-eller protein-protein-tværbinding. De tillader mere kontrollerede to trin reaktioner, der minimerer uønskede selv-konjugation og polymerisation, som opstår, når homo-bifunktionelle NHS-ester reagenser anvendes. I det første trin reagerer NHS-ester with primære aminer, der amino bindinger. I det andet trin reagerer maleimid med sulfhydrylgrupper danner thioesterbindinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omtale af handelsnavne af kommercielle produkter i publikationen er alene til formål at give specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af US Department of Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20 % Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
