Summary
Sebrafisk er en voksende system for å modellere humane sykdommer i skjelettmuskel. Vi beskriver en rask og effektiv metode for å isolere skjelettmuskel myofibers fra embryo-og larvesebrafisk. Denne metode gir en høy tetthet myofiber preparat egnet for undersøkelse av enkeltskjelettmuskelfiber morfologi, protein subcellulære lokalisering, og muskel-fysiologi.
Abstract
Den sebrafisk har vist seg å være en verdifull modellsystem for å utforske skjelettmuskelfunksjon og for å studere menneskelige muskelsykdommer. Til tross for de mange fordelene som tilbys av in vivo analyse av skjelettmuskulatur i sebrafisk, visualisere komplekse og fint strukturert protein miljø ansvarlig for muskelfunksjonen, særlig i hele embryo, kan være problematisk. Dette hindring stammer fra den lille størrelsen på sebrafisk skjelettmuskulatur (60 mikrometer) og enda mindre størrelse på sarcomere. Her beskriver vi og vise en enkel og rask metode for å isolere skjelett myofibers fra sebrafisk embryo og larver. Vi inkluderer også protokoller som illustrerer legg forberedelse teknikker som er nyttige for å analysere muskel struktur og funksjon. Nærmere bestemt, vi detalj den påfølgende immunocytochemical lokalisering av skjelettmuskelproteiner og kvalitativ analyse av stimulert kalsium utgivelsen via live celle kalsium bildebehandling. Samlet sett denne videoenArtikkelen gir en rett-frem og effektiv metode for isolering og karakterisering av sebrafisk skjelett myofibers, en teknikk som gir en kanal for utallige etterfølgende studier av muskel struktur og funksjon.
Introduction
Skjelettmuskel er et høyt spesialisert vev ansvarlig for å generere de kontraktile krefter som er nødvendige for motilitet. Sammentrekning er initiert gjennom en prosess som kalles eksitasjon-kontraksjon (EF) kobling som konverterer elektriske signaler til kalsium utgivelse fra intracellulære butikker 1,2. Intracellulær kalsium utgivelsen aktiverer sarcomere å forkorte og generere kraft. De mange spesifikke komponenter av molekylære maskiner ansvarlig for formidling av nevromuskulær veikryss overføring 3, EC kopling 4,5, og aktin-myosin avhengige sammentrekninger 6 fortsette å være den pågående gjenstand for intens forskning. I tillegg er proteiner som stabiliserer muskelmembranen under sammentrekning 7,8, og som formidler signalering mellom myofiber og den ekstracellulære matriks 7,9 Det er oppdaget og undersøkt i stor detalj.
Mutasjoner i en rekke gener som er viktige for muskelstruktur ennd funksjon har blitt identifisert som årsaker til menneskelige skjelettmuskelsykdommer ( http://www.musclegenetable.org/ ). Disse sykdommene, klassifisert bredt som skjelett myopatier og muskeldystrofier basert på kliniske og histopatologiske funksjoner, er assosiert med muskelsvakhet, livslang uførhet og tidlig død 10,11. Sebrafisk har vist seg å være en fremragende system for modellering og studere menneskelige skjelettmuskelsykdommer 8,12,13. Det har blitt ansatt for å validere nye genmutasjoner 8, definere nye aspekter av sykdoms patofysiologien 14,15, og identifisere nye terapeutiske tilnærminger 15,16. Kraften av sebrafisk for å studere menneskelig muskel sykdom relatert til det store antall avkom, den raske utviklingen av muskel struktur og funksjon, den optiske klarhet i sebrafisk embryo, og den enkle genetiske og farmakologisk manipulasjon av utviklings sebrafisk 17.
Vi og andre 12,18,19 har nylig utviklet en enkel teknikk for rask og effektiv isolering av myofibers fra utviklingssebrafisk. Denne metodikken har aktivert undersøkelsen av myofibers i større detalj enn det som kan tilbys av hele embryo analyse. Teknikken har vært utnyttet for karakterisering av protein subcellulære lokalisering 20, så vel som for identifisering av histopatologiske viktige egenskaper som en del av valideringsstudier i nyutviklede sykdomsmodeller 21. Videre kan isolerte myofibers i tillegg bli brukt for direkte avbildning og for elektrofysiologiske studier 22, teknikker som gir mulighet for avlesning av de viktigste aspektene av muskelfunksjonen. Den spesifikke protokollen for myofiber isolasjon, sammen med to eksempler på senere analytiske eksperimenter, er detaljert i de resterende delene av dette manuskriptet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forberedelse av Poly-L-lysin Coated Dekk (Tid: 1 time)
Coating Dekk muliggjør rask myofiber ling og heft. Dette kan bli utført i løpet av dissosiasjon trinn av myofiber isolert (trinn 2 nedenfor).
- Klipp og plassere Parafilm på bunnen av en 60 mm petriskål (alle merker).
- Plasser mikroskop dekkglass slips (12 mm diameter) på Parafilm i en 60 mm vev kultur parabolen eller plassere dem individuelt i enkeltbrønner av 24-brønners plater.
Merknad 1: Disse små runde Dekk bidra til å konsentrere myofiber tall og redusere overflødig antistoff bruk.
Note 2: Andre størrelse Dekk vil fungere, men vil volumene av reagenser og embryoer som benyttes må justeres tilsvarende.
- Pipetter 50-200 mL av poly-L-lysin løsning (0,01%) på hver frontglass i petriskål.
- Tillat Dekk å sitte minst én hour ved 37 ° C. Lengre inkubasjoner ikke vil negativt påvirke resultatene.
- Fjern poly-L-lysin løsning fra dekkglass og vaskes to ganger med et minimum av 100 pl 1 x PBS.
- Tillat Dekk tørke.
- Dekk er nå klar for myofibers.
Merknad 3: For å sikre sterilitet, kan belegg gjøres på en hette og på autoklaveres Dekk.
Note 4: Hold 60 mm petriskål med Parafilm på bunnen. Dette oppsettet vil bli brukt under myofiber plating og immunolabeling (senere trinn).
Alternativ 1: I stedet for belegging Dekk umiddelbart før bruk, en belagt dekk lager kan anvendes. En 60 mm petriskål inneholdende et minimum på 2 ml poly-L-lysin kan bli lagret ved 4 ° C inneholdende tallrike dekkglass. Med dette alternativet starter på trinn 1,5 til å behandle Dekkglass for myofibers.
Alternativ 2: Vi har også klesDekk i poly-L-ornitin. Thans er mer arbeidskrevende, men er nyttig for lengre sikt dyrking fordi poly-L-ornitin belagt dekkglass kan være UV behandlet. Med UV-behandling og forsiktig steril teknikk levende myofibers kan vanligvis holdes i kultur fra 4-7 dager.
2. Dissosiasjon av sebrafisk embryo og plating av myofibers (Tid: 1 til 3 timer)
Merk: standard protokoll gjelder best å tre DPF (dager etter befruktning) embryoer.
- Overfør sebrafisk embryoer i et standard 1,5 ml sentrifugerør og fjerne så mye overflødig fisk vann som mulig. Vanligvis kan 10-20 embryoer per rør, men mindre brukes. Bruk av mer enn 20 til 25 embryoer ofte resulterer i et preparat av overdreven tetthet.
- Fjern chorions før dissosiasjon, manuelt med # 5 tang. Alternativt kan kjemisk chorion fjerning oppnådd med en 10-15 min Pronase-behandling. Vanligvis er den tidligere fjernelse av chorion bare nødvendig når før bekreftelse av en mutmaur fenotype eller morfologi er nødvendig, eller når du bruker scener der embryoer er naturlig klekket fra sin chorion.
- Legg 900 mL av CO 2 uavhengige medier til røret som inneholder embryoene.
- Tilsett 100 ul av kollagenase type II, sluttkonsentrasjon 3,125 mg / ml (Stock kollagenase løsning på 31.25 mg / ml fortynnet i 1 x PBS) for å begynne dissosiasjon. Collagenase IV kan også anvendes for dissosiasjon.
- Roter embryoer på en orbital shaker, og Triturer hvert 30 min ved RT bruke en P1000 Pipetman for trituration.
Merknad 2: Følg nøye med embryo dissosiasjon, over eller under dissosiasjon (særlig over) er de vanligste årsakene til protokollfeil. Tider for digerering vil variere avhengig av intensiteten av triturering, antall embryoer pr røret, og alder på embryoer. Det er også ofte mindre (i forhold til vill type) for embryoer fra skjelettmuskel mutanter.
Note3: Gjennomsnittlig fordøyelsen tid per embryo alder: 1 dpf = 1 hr, 2 DPF = 1,5 timer, 3 dpf = 2 hr, og fire DPF = 2-2,5 time.
- Stopp fordøyelsen når ingen hele embryoer er synlige, men likevel solide stykker er fortsatt synlige - dette er avgjørende for å hindre overdigestion.
- Sentrifugerør med dissosiert embryoer ved 0,8 til 2,3 xg for 3-5 min til pellets celler.
- Fjern supernatanten fra pelleterte celler og vaske 2x med CO 2 uavhengige medier.
- Legg frisk CO 2 uavhengige medier å resuspender celler. 1 ml brukes vanligvis for forbereder av 10-20 embryoer. Volumet kan bli skalert basert på embryo nummer.
- Ved hjelp av en P1000 pipette, passere embryo suspensjon gjennom en 70 mikrometer filter. Dette bidrar til å fjerne uønsket rusk fra prep.
Note 4: Embryo suspensjon kan filtreres en gang gjennom en 40 mikrometer filter for å fjerne uønsket rusk videre. Fra en dobbel filtrering, er utvinning approximbart 800 mL fra en startvolum på 1 ml.
- Legg ca 50-100 mL av myofiber suspensjon til hver poly-L-lysin belagt dekkglass.
Note 5: Utfør trinn 2.9 i petriskåler med Parafilm på bunnen, som tidligere fremstilt. Den Parafilm holder myofiber suspensjon fra å kjøre av de belagte Dekk. Hold petriskåler dekket for å hindre fordamping.
- Tillat myofibers å avgjøre om lag 1 time på den belagte dekkglass ved romtemperatur.
Note 6: myofibers vil begynne å bosette seg innenfor 5-10 min. Men for god myofiber vedlegg, er et minimum av en time (1-2 timer) anbefales. Tillater myofibers å bosette seg lenger vil ikke skade prep. For lengre inkubasjoner (inkludert overnatting), kan antibiotika bli lagt til media. Med antibiotika og steril teknikk levende kulturer kan vanligvis holdes i 1-2 dager.
- Live-myofibers kan observeres på dette punktet. Myofibers fra embryoer 2 DPF og senere vil bli sett på som tverrstripet og langstrakte celler (figur 1). På dette punktet, myofibers er nå klar for live analyse eller for immunolabeling.
Note 7: Skjelettmuskulatur fra en dpf embryoer ikke platen som langstrakte og tydelig tverrstripet fibre. I stedet, store myoballs er synlige. I tillegg, under pelleteringsprosessen fase etter dissosiasjon (trinn 2.6), en dpf myoballs må sentrifugeres i minst 8 minutter ved 5000 x g for å oppnå en pellet. For analyse av embryoer på dette stadiet, er det anbefalt å bruke den transgene linjen uttrykker EGFP spesielt i skjelettmuskulatur 23. Dette vil tillate identifisering av celler fra muskel opprinnelsen sammenlignet med andre kilder.
Tre. Fluorescens Immunostaining av Disso-sierte Sebrafisk myofibers (Tid: ca 1 dag)
3.1. Immunolabeling
- Ta en porsjon avmedia fra myofibers levd opp til den belagte dekk
- Fix celler ved hjelp av 4% paraformaldehyde eller metanol. For PFA, fjerne ½ volumet av media og erstatte med samme mengde PFA. Fix for 10 min ved RT, deretter fjerne totale volumet, erstatte med 50-100 mL av PFA, og fikse for en ekstra 10 min. For fiksering av alkohol, iskald metanol eller aceton kan anvendes ved 4 ° C i 10 min og 5 min, respektivt.
- Vask myofibers minst 3-5x med 1x PBS eller 1x PBS pluss 0,1% Tween. Gjennomsnittlig vask volum er 50-100 mL per dekkglass.
- Til å blokkere løsning myofibers (arbeidslager) og inkuberes 20-60 minutter ved romtemperatur. Blokkering løsning vil variere avhengig av de primære og sekundære antistoffer. De to mest vanlig brukt i laboratoriet er (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA, 1% saueserum, 0,25% Triton X-100 endelig og (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0.2 % BSA) og 5% saue / geiteserum.
- Fjern blokkering løsning og legge primære antistoffet fortynnes i enten blåse løsning eller PBS. Inkuber myofibers natten ved 4 ° C. Sørg for å enten Parafilm eller pakk i Saran vikle petriskål som inneholder myofiber-lastet Dekk belagt med antistoff. Små stykker av fuktet papirhåndkle kan tilsettes for å skape et fuktet kammer.
- Fjern primære antistoff fra dekkglass og dekkglass vaskes 3-5x i 5 minutter med PBS eller en blokkerende oppløsning.
- Legg sekundært antistoff ved passende konsentrasjon fortynnet i 1 x PBS eller blokkering løsning for 1-2 timer ved romtemperatur.
- Fjern sekundært antistoff og vask myofibers 3-5x i PBS i 5 minutter hver ved RT.
3.2. Monteringsdekk
- Påfør 1-2 dråper antifade reagens til et objektglass.
- Nøye henting den belagte og immunolabled dekkglass med tang og sted (myofibers ned) dekkglass på antifade reagens på objektglass.
Merknad 1: Oppmerksomhet til retningen på coated dekk er kritisk.
- Lå 1-2 Kimwipes på et hardt fast underlag. Raskt invertere lysbilde med de belagte Dekk hviler på antifade reagens og sett den (dekk ned) på Kimwipes.
- Påfør lett trykk til hjørnene av objektglass for å fjerne overflødig antifade og danner en tett forsegling mellom raset og dekkglass
- Tillat den antifade værende tørke i 5-10 min ved RT, deretter myofibers er klar til å bilde (figurene 2A og B), eller lagres ved 4 ° C.
4. Live-Cell Kalsium Imaging Bruke GCaMP3
Live-celle eksperimenter kan utføres på myofibers før fiksering (følgende trinn 2.10). Følgende protokoll beskriver levende bildebehandling i myofibers uttrykker GCaMP3 24, en genetisk kodet kalsium indikator, uttrykt ved skjelettmuskelspesifikke sebrafisk α-aktin promoter (pSKM) 23. Alternativtdenne teknikken kan lett tilpasses til å bruke kalsium-stoffer slik som Fura-2.
- Injisere embryoer med pSKM: GCaMP3 konstruere på 1-2 cellestadiet
- På tre dpf, samle larver og forberede myofibers som beskrevet i pkt. 1 og 2. Tillat myofibers å følge i minst 1 time. For denne teknikken, forbereder Dekk i 24-brønners retter nødvendig.
- Fjern forsiktig overflødig media, og legge til 300 mL av fersk CO 2 uavhengige medier på RT.
- Observere celler under en invertert mikroskop. GCaMP3 positive myofibers skal være synlig under grønn fluorescens.
- Sett opp kameraet for opptak, hvis det er ønskelig.
- Forbered en 30 mM koffein løsning i CO 2 uavhengige medier. For å stimulere cellene, forsiktig pipettere 300 mL av koffeinløsning inn i brønnen under forstørrelse. Innen 5-10 sek, bør GCaMP positive myofibers svare på koffein med en rask økning i fluorescens (figur 3). Myofibere kan også kontrakt. Av notatet, induserer koffein kalsium utgivelse fra det sarkoplasmatisk retikulum lagrer 25. Andre midler, slik som KCl 26 og ryanodine 4, kan brukes til å studere induserbar kalsium-frigjøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescent immunolabeling av myofibers (figur 2)
Bilder som viser forventet fluorescerende merking mønster fra myofibers immunostained etter vellykket isolasjon og platekledning. De myofibers har blitt merket med enten anti-ryanodine reseptor (1:100) (figur 2A), eller anti-α-actinin (1:100) (figur 2B)-antistoffer, og avslører farging av triaden og Z-bånd hhv. Sekundære antistoffer som ble brukt var Alexa Fluor 555 (1:500). Bilder tatt med konfokalmikroskopi.
Indusert kalsium utgivelse fra en myofiber (figur 3)
Panel serien viser representanten kalsium utgivelsen fra en isolert myofiber behandlet med koffein. I korte trekk, ble sebrafisk embryo injisert på den ene cellen scenen med pSKM: GCaMP3 konstruere. Ved 3 dpf, ble embryoer dissosiert og belagt som beskrevet i protocol. For analyse ble det GCaMP3 uttrykker myofibers valgt, som antydet ved tilstedeværelse av grønn fluorescens ved utgangspunktet. Ved hjelp av en mikropipette for legemiddeladministrering, ble den valgte fiberen badet i en 30 mM koffein løsning for å indusere frigjøring av kalsium. Videoopptak ble startet før koffein søknad og fortsatte til topp fluorescens ble nådd. Denne figuren viser normal koffein indusert kalsium-frigjøring og teknikken kan anvendes til å lese av eksitasjon-kontraksjon koblingsapparat via direkte avbildning.
Figur 1. Skjematisk Tidslinje av Embryo Dissosiasjon. Følgende paneler (topp til bunn) illustrere enkelte trinn, timing, og utstyr som kreves for embryo dissosiasjon. A) Valg av embryoer for dissosiasjon. Scale bar 500 mikrometer. B) Jegmage av dissosiasjon oppsett. Embryoer er i media og kollagenase mens blir rotert inntil tilstrekkelig dissosiert (Protocol trinn 2) C) Bilde av begge myofiber pletteringsteknikker,. Runde dekkglass eller 24-brønners plater (Protocol trinn 1 og 4, henholdsvis) D) En lys-feltet. bilde av levende dissociated sebrafisk myofibers belagt på poly-L lysin belagt dekkglass. Piler betegne langstrakte myofibers fra 48 HPF sebrafisk. Scale bar 30 mikrometer.
Figur 2. Immunolabeling av individuelle myofibers isolert fra 48 HPF sebrafisk embryo. A) myofiber merket med anti-ryanodine reseptor (RyR1), avslører en båndmønster langs fiber forenlig med lokalisering til triaden / EF koblingsapparat. B) myofiber merket med anti-α -actinin, visualizin g striper (rød) langs myofiber lokalisere til sarcomere og fremhever Z band. I begge bildene, er atomkjerner merket med DAPI, sett på som blå ovaler. Setter inn viser høyere forstørrelse bilder av myofiber i det store bildet. A) og B) skala bar 30 mikrometer.
Figur 3. Representant indusert kalsium utgivelsen respons fra en enkelt isolert sebrafisk myofiber. Alle panelene viser en pseudocolored sebrafisk myofiber uttrykke GCaMP3. Tidsforløpet viser økningen av GCaMP3 fluorescens (rød farge) som reaksjon på påføring av 30 mM koffein. Opptak startet før koffein søknad (0 msek) og fortsatte å maksimal fluorescens respons (992 msek). Scale bar 30 mikrometer.nk "> Klikk her for å se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk er en kraftig virveldyr modellsystem for å studere muskelutvikling og funksjon in vivo 25,27,28. De har også dukket opp som en verdifull ressurs for å modellere menneskelige muskelsykdommer 14,15,20,29. Mens store fremskritt har blitt tatt for å fremme bruk og anvendelse av sebrafisk for studier av muskelfunksjon og muskelsykdommer, er det et konstant kritisk behov for å utvikle verktøy som vil tillate mer grundig analyse som compliments genetisk, morfologiske, atferdsmessige og funksjonelle fordeler sebrafisk allerede tilbyr 17. Vi har derfor tilpasset og utviklet en enkel og robust teknikk for karakterisering av sebrafisk myofibers fra dissosiert hele embryoer.
Bruken av individuelle myofibers er vanlig i studier ved bruk av den murine modellen system. Hos mus har dette åpnet for undersøkelser og analyser som er upraktisk eller umulig i hele dyr, inkluding subcellulær protein lokalisering studerer 30, live cell imaging 31, og elektrofysiologiske målinger 32. I sebrafisk, har lignende dissosiasjon teknikker tidligere blitt utviklet spesielt for å identifisere og undersøke motorneurons 33 samt Rohon-Beard sensoriske nevroner 34, og disse teknikkene har aktivert detaljert analyse av disse nervecellen subtyper.
Den bred anvendelse av isolerte myofibers, kombinert med de mange unike fordeler sebrafisk tilbyr som et virveldyr modell 17, er hva som motiverte oss til å utvikle en teknikk for å isolere og karakterisere embryonale-og larvesebrafisk myofibers. Vi har benyttet isolerte myofibers i tidligere studier for å fastslå subcellulære lokalisering av muskelproteiner 20,21, for å studere lokalisering av chimerically uttrykt transgener 35 og definere konkrete myofiber parametere inkludert spesielt størrelse
Grabner og kolleger har også brukt myofiber systemet til stor suksess 19,22,36. De er den eneste gruppen å rapportere langvarig dyrking av isolerte fibre. Dessuten har de vært i stand til å bruke fibrene for å måle de elektrofysiologiske egenskapene til muskel. Nærmere bestemt har de testet effekten av tapet av beta-underenheten av dihydropyridin-reseptoren på kalsium-frigjøring og målte evnen til et sett med transgener for å redde defeCTS i denne utgivelsen. Disse studiene belyse noen av de svært kraftige potensielle anvendelser av isolerte myofibers.
En annen gruppe for å rapportere bruk av myofiber prep for å studere muskelsykdommer er Nixon et al. Som brukte myofibers å studere virkningen av morpholino mediert caveolin tre knockdown på muskelutvikling og muskelstruktur 18. Disse forfatterne ikke bare undersøkte parametere ved lysmikroskopi, men også studert i fibrene ved hjelp av elektronmikroskopi. Deres arbeid viser enda en annen fordel med den isolerte myofiber system: evnen til å studere ultrastructure av myofiber i en isolert og kontrollert innstilling.
Disse studiene, sammen med vårt arbeid, peker på den potensielle omfattende nytten av denne teknikken. Tilleggsprogrammer er sikker på å bli utviklet, for eksempel måling av raske kalsium pigger bruker indikatorer som Fura-2. I tillegg, dette preparatet tilbyr muligheten til observasjonerve elektrisk aktivitet, som for eksempel aksjonspotensialer via spenningsfølsomme fargestoffer (Di-4-ANEPPS) eller direkte elektrofysiologisk registrering. Det synes klart at alle aktuelle teknikker som brukes på murine myofibers bør gjelde for sebrafisk myofibers. I tillegg er evnen til å uttrykke forskjellige transgener i den tredje sebrafisk, så vel som tilgjengeligheten av et stort og økende antall transgen sebrafisk som uttrykker forskjellige markørproteiner ( www.zfin.org ), legger til et ekstra lag av kompleksitet og anvendelighet for det system. Vi viser dette faktum med myofibers dyrkede fra GCaMP3 uttrykke sebrafisk, der vi dra nytte av muligheten til å uttrykke GCaMP3 i muskel å studere indusert kalsium bildebehandling i sanntid i isolerte fibre (figur 3).
Som med de fleste teknikker, er det også noen klare begrensninger i den isolerte myofiber system. Disse problemene er i tillegg til stativetard manglene ved å studere en celletype in vitro som fungerer som en tredimensjonal syncytia in vivo, og for å utføre elektrofysiologiske eksperimenter med nonphysiologic stimuli. Ved hjelp av vår metodikk, er man ikke i stand til å hente en ren forberedelse av myofibers. Dette er ikke et problem for farging eller for elektrofysiologiske målinger, men det utelukker visse eksperimentelle tilnærminger. For eksempel har vi ennå til å bestemme en egnet metode for å identifisere en ren populasjon av myofibers for transcriptomic analyse. Vi har forsøkt FACS sortering av GFP uttrykker myofibers fulgt av myofiber fremstilling, men dette har ikke ført til en ren kultur med et passende antall myofibers for enten RNA eller protein-analyse.
En annen utfordring er den langsiktige dyrking av myofibers. Vi har vært i stand til å holde kulturer for ca 24 timer, og Grabner og kolleger rapporterer et preparat som har vært suitagjengelig for flere dager med eksperimentering 19. Utfordringen i forbindelse med dette aspektet av den teknikk som hindrer forurensning, da disse kulturer (mye som murine myofiber preps) er ofte vanskelig å holde sterile. Stor forsiktighet er nødvendig hvis man skal forsøke langvarig kulturer. Vi anbefaler også bruk av antimikrobielle stoffer inkludert soppmidler.
I alt, vi demonstrere en praktisk metode for isolering av sebrafisk myofibers samt skissere hvordan du utfører fluorescerende immunolabeling og sanntid kalsium bildebehandling på de isolerte fiber forberedelsene. Fortsetter modifisering og utvikling av denne teknikken vil tilby et stadig voksende repertoar av verktøy for å eksperimentere på konkrete, isolerte celletyper i sebrafisk. Ved dissociating sebrafisk embryo til isolerte enkelt myofibers, kan vi ytterligere forbedre vår forståelse av muskel utvikling, funksjon og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen motstridende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke medlemmene i Dowling lab (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, og William Telfer) som bidro til utviklingen av teknikken og til produksjon av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Taubman institutt, Institutt for pediatri ved University of Michigan, og dels fra tilskudd fra muskeldystrofi Association (JJD MDA186999) og National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
