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Biology

अलग तैयारी से भ्रूण और लार्वा zebrafish कंकाल myofibers का विश्लेषण

Published: November 13, 2013 doi: 10.3791/50259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

Summary

Zebrafish कंकाल की मांसपेशी के मानव विकारों मॉडलिंग के लिए एक उभरती हुई व्यवस्था कर रहे हैं. हम भ्रूण और लार्वा zebrafish से कंकाल की मांसपेशी myofibers अलग करने के लिए एक तेज और कुशल विधि का वर्णन. यह विधि एक ही कंकाल की मांसपेशी फाइबर आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयुक्त उच्च घनत्व myofiber तैयारी, प्रोटीन subcellular स्थानीयकरण, और मांसपेशियों शरीर विज्ञान पैदावार.

Abstract

zebrafish कंकाल की मांसपेशी समारोह की खोज के लिए और मानव मांसपेशियों की बीमारियों के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. विशेष रूप से पूरे भ्रूण में, मांसपेशी समारोह के लिए जिम्मेदार जटिल और पतले संरचित प्रोटीन परिवेश visualizing, zebrafish में कंकाल की मांसपेशी के vivo विश्लेषण द्वारा की पेशकश कई फायदे के बावजूद, समस्याग्रस्त किया जा सकता. इस बाधा zebrafish कंकाल की मांसपेशी (60 माइक्रोन) और sarcomere के भी छोटे आकार का छोटे आकार की वजह से उपजी. यहाँ हम का वर्णन है और zebrafish भ्रूण और लार्वा से कंकाल myofibers अलग करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि प्रदर्शित करता है. हम यह भी मांसपेशियों संरचना और समारोह का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी पोस्ट तैयार करने की तकनीक है कि वर्णन प्रोटोकॉल शामिल हैं. विशेष रूप से, हम विस्तार से कंकाल की मांसपेशी प्रोटीन के बाद immunocytochemical स्थानीयकरण और लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से प्रेरित कैल्शियम रिहाई के गुणात्मक विश्लेषण. कुल मिलाकर, इस वीडियोलेख zebrafish कंकाल myofibers के अलगाव और लक्षण, मांसपेशी संरचना और समारोह के असंख्य बाद के अध्ययन के लिए एक नाली प्रदान करता है जो एक तकनीक के लिए एक सीधे आगे और कारगर तरीका प्रदान करता है.

Introduction

कंकाल की मांसपेशी गतिशीलता के लिए आवश्यक सिकुड़ा बलों पैदा करने के लिए जिम्मेदार एक अति विशिष्ट ऊतक है. संकुचन intracellular दुकानों 1,2 से कैल्शियम रिहाई के लिए विद्युत संकेतों को धर्मान्तरित कि उत्तेजना संकुचन (ईसी) युग्मन के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से शुरू की है. Intracellular कैल्शियम रिहाई बल छोटा और उत्पन्न करने के लिए sarcomere सक्रिय. neuromuscular जंक्शन प्रसारण 3, चुनाव आयोग युग्मन 4,5, और actin-मायोसिन निर्भर संकुचन 6 मध्यस्थता के लिए जिम्मेदार आणविक मशीनरी के कई विशिष्ट घटकों को गहन अनुसंधान के चल रहे विषय बने हुए हैं. इसके अलावा, संकुचन 7,8 और myofiber और बाह्य मैट्रिक्स 7,9 के बीच संकेत है कि मध्यस्थता के दौरान मांसपेशियों झिल्ली को स्थिर प्रोटीन है कि पहचान की गई है और महान विस्तार से अध्ययन किया.

मांसपेशियों संरचना एक के लिए महत्वपूर्ण जीनों के एक नंबर में उत्परिवर्तनएन डी समारोह (मानव कंकाल मांसपेशियों की बीमारियों का कारण के रूप में पहचान की गई है http://www.musclegenetable.org/ ). नैदानिक ​​और histopathologic सुविधाओं के आधार पर कंकाल myopathies और पेशी अपविकास के रूप में मोटे तौर पर वर्गीकृत इन रोगों,, मांसपेशियों में कमजोरी, आजीवन विकलांगता, और जल्दी मृत्यु दर 10,11 के साथ जुड़े रहे हैं. zebrafish मानव कंकाल मांसपेशियों की बीमारियों 8,12,13 मॉडलिंग और अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली साबित हो गया है. यह नए जीन म्यूटेशन 8 मान्य रोग pathophysiology 14,15 के नए पहलुओं को परिभाषित है, और नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण 15,16 की पहचान करने के लिए नियोजित किया गया है. मानव मांसपेशियों की बीमारी का अध्ययन के लिए zebrafish के सत्ता वंश, मांसपेशियों संरचना और समारोह, zebrafish भ्रूण की ऑप्टिकल स्पष्टता, और विकासशील ज़ेबरा की आनुवंशिक और pharmacologic हेरफेर की आसानी के तेजी से विकास की बड़ी संख्या से संबंधित हैमछली 17.

हम और दूसरों 12,18,19 हाल ही में विकासशील zebrafish से myofibers का तेजी से और कुशल अलगाव के लिए एक सरल तकनीक विकसित की है. इस पद्धति को पूरे भ्रूण विश्लेषण द्वारा प्रदान किया जा सकता है की तुलना में अधिक से अधिक विस्तार में myofibers की परीक्षा के लिए सक्षम है. तकनीक नव विकसित रोग मॉडल 21 में सत्यापन के अध्ययन के हिस्से के रूप में महत्वपूर्ण histopathologic विशेषताओं की पहचान के लिए प्रोटीन subcellular स्थानीयकरण 20 के साथ ही के लक्षण वर्णन के लिए दोहन किया गया है. इसके अलावा, पृथक myofibers साथ ही रहते इमेजिंग के लिए और electrophysiological पढ़ाई 22, मांसपेशी समारोह के महत्वपूर्ण पहलुओं की पूछताछ के लिए अनुमति देते हैं कि तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाद में विश्लेषणात्मक प्रयोगों के दो उदाहरण के साथ myofiber अलगाव के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल, इस पांडुलिपि के शेष भागों में विस्तृत है.

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Protocol

1. पाली एल lysine की तैयारी लेपित coverslips (समय: 1 घंटा)

कोटिंग coverslips तेजी myofiber निपटाने और आसंजन के लिए अनुमति देता है. इस myofiber अलगाव (नीचे चरण 2) की हदबंदी कदम के दौरान किया जा सकता है.

  1. काटें और एक 60 मिमी पेट्री डिश (किसी भी ब्रांड) के तल पर Parafilm जगह है.
  2. एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान में Parafilm पर माइक्रोस्कोप कांच कवर फिसल जाता है (12 मिमी व्यास) रखें या 24 अच्छी तरह से प्लेटों के एकल कुओं में अलग - अलग जगह है.

नोट 1: इन छोटे दौर coverslips myofiber संख्या ध्यान केंद्रित करने और अतिरिक्त एंटीबॉडी के उपयोग को कम करने के लिए मदद करते हैं.

नोट 2: अन्य आकार coverslips काम करेंगे, लेकिन, इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और भ्रूण की मात्रा के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होगी.

  1. पिपेट पेट्री डिश में प्रत्येक कवर कांच पर पाली एल lysine समाधान (0.01%) की 50-200 μl.
  2. Coverslips कम से कम एक हो बैठने की अनुमति37 डिग्री सेल्सियस पर उर लंबे समय तक incubations नकारात्मक परिणामों को प्रभावित नहीं करेगा.
  3. कवर कांच से पाली एल lysine समाधान निकालें और 100 μl 1x पीबीएस की एक न्यूनतम के साथ दो बार धोने.
  4. Coverslips सूखे की अनुमति दें.
  5. Coverslips अब myofibers के लिए तैयार हैं.

3 नोट: बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए, कोटिंग एक हुड में और autoclaved coverslips पर किया जा सकता है.

4 नोट: तल पर Parafilm के साथ 60 मिमी पेट्री डिश रखें. इस सेटअप myofiber चढ़ाना और immunolabeling (बाद में कदम) के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा.

विकल्प 1: के बजाय का उपयोग करने के तुरंत पहले कोटिंग coverslips की, एक लेपित coverslip शेयर किया जा सकता है. 2 मिलीलीटर पाली एल lysine की एक न्यूनतम युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश कई coverslips युक्त 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. इस विकल्प के साथ myofibers के लिए coverslips पर कार्रवाई करने के लिए 1.5 कदम पर शुरू करते हैं.

विकल्प 2: हम भी पाली एल ओर्निथिन में कोट coverslips. टीउसकी गहन अधिक परिश्रम है, लेकिन पाली एल ओर्निथिन लेपित coverslips यूवी इलाज किया जा सकता है क्योंकि लंबी अवधि के संवर्धन के लिए उपयोगी है. यूवी इलाज और सावधान बाँझ तकनीक के साथ लाइव myofibers आम तौर पर 4-7 दिनों से संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है.

2. Myofibers के Zebrafish भ्रूण और चढ़ाना (: 1 से 3 घंटे का समय) की हदबंदी

नोट: मानक प्रोटोकॉल 3 DPF (दिनों के बाद निषेचन) भ्रूण को सबसे अच्छा लागू होता है.

  1. एक मानक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में zebrafish भ्रूण स्थानांतरण और जितना संभव हो उतना अतिरिक्त मछली पानी निकाल दें. आमतौर पर, कम हालांकि ट्यूब प्रति 10-20 भ्रूण का इस्तेमाल किया जा सकता है. अधिक से अधिक 20-25 भ्रूण का उपयोग अक्सर अत्यधिक घनत्व की तैयारी में परिणाम है.
    1. मैन्युअल रूप से 5 संदंश # का उपयोग कर, पूर्व हदबंदी को chorions निकालें. वैकल्पिक रूप से, रासायनिक जरायु हटाने की एक 10-15 मिनट Pronase उपचार के साथ हासिल की है. आमतौर पर, जरायु के पिछले हटाने केवल जरूरत है जब एक MUT की पूर्व पुष्टिचींटी फेनोटाइप या आकृति विज्ञान की आवश्यकता है, या चरणों का उपयोग करते समय भ्रूण स्वाभाविक रूप से उनके जरायु से रची कर रहे हैं.
  2. भ्रूण युक्त ट्यूब के लिए सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया के 900 μl जोड़ें.
  3. 100 collagenase प्रकार द्वितीय के μl, अंतिम एकाग्रता 3.125 मिलीग्राम / एमएल हदबंदी शुरू करने के लिए (31.25 मिलीग्राम / 1x पीबीएस में पतला एमएल शेयर collagenase समाधान) जोड़ें. Collagenase चतुर्थ भी हदबंदी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. एक कक्षीय हिलनेवाला पर भ्रूण घुमाएँ, और विचूर्णन के लिए एक P1000 Pipetman का उपयोग आरटी पर हर 30 मिनट triturate.

नोट 2: ध्यान से भ्रूण हदबंदी की निगरानी, ​​(विशेष रूप से अधिक) से अधिक या हदबंदी के तहत प्रोटोकॉल विफलता के लिए सबसे आम कारण हैं. पाचन के लिए टाइम्स विचूर्णन, ट्यूब प्रति भ्रूण की संख्या, और भ्रूण की उम्र की तीव्रता के आधार पर अलग अलग होंगे. यह भी कंकाल की मांसपेशी म्यूटेंट से भ्रूण के लिए (जंगली प्रकार की तुलना में) अक्सर कम है.

नोट3: भ्रूण उम्र प्रति औसत पाचन समय: = 1 घंटा 1 DPF, 2 DPF = 1.5 घंटा, 3 DPF = 2 घंटा, और = 2-2.5 घंटा 4 DPF.

  1. कोई पूरे भ्रूण दिखाई दे रहे हैं, अभी तक ठोस टुकड़े अभी भी दिखाई दे रहे हैं जब पाचन बंद करो - इस overdigestion को रोकने के लिए आवश्यक है.
  2. गोली कोशिकाओं को 3-5 मिनट के लिए 0.8-2.3 XG पर अलग भ्रूण के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों.
  3. Pelleted कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला निकालें और सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया के साथ 2x धो लो.
  4. कोशिकाओं resuspend ताजा सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया जोड़ें. 1 मिलीलीटर आमतौर पर 10-20 भ्रूण की preps के लिए प्रयोग किया जाता है. मात्रा भ्रूण संख्या के आधार पर बढ़ाया जा सकता है.
  5. एक P1000 विंदुक का प्रयोग, एक 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से भ्रूण निलंबन गुजरती हैं. इस प्रस्तुत करने से अवांछित मलबे को हटाने में मदद करता है.

नोट 4: भ्रूण निलंबन आगे अवांछित मलबे को हटाने के लिए एक 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एक दूसरे समय फ़िल्टर किया जा सकता. एक डबल निस्पंदन से वसूली approxim है1 मिलीलीटर की एक प्रारंभिक मात्रा से ately 800 μl.

  1. प्रत्येक पाली एल lysine लेपित coverslip को myofiber निलंबन की लगभग 50-100 μl जोड़ें.

5 नोट: तल पर Parafilm के साथ पेट्री डिश में कदम 2.9 प्रदर्शन करना, पहले से तैयार है. Parafilm लेपित coverslips बंद चलने से myofiber निलंबन रहता है. वाष्पीकरण को रोकने के लिए कवर पेट्री डिश रखें.

  1. Myofibers कमरे के तापमान पर लेपित coverslips पर लगभग 1 घंटा व्यवस्थित करने की अनुमति दें.

6 नोट: myofibers 5-10 मिनट के भीतर व्यवस्थित करने के लिए शुरू हो जाएगा. लेकिन, अच्छी myofiber लगाव के लिए, 1 घंटा (1-2 घंटा) की एक न्यूनतम सिफारिश की है. Myofibers देर के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दे प्रस्तुत करने का नुकसान नहीं होगा. (रातोंरात सहित) अब incubations के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं मीडिया को जोड़ा जा सकता है. एंटीबायोटिक दवाओं और बाँझ तकनीक के साथ लाइव संस्कृतियों आम तौर पर 1-2 दिनों के लिए रखा जा सकता है.

  1. लाइव एमyofibers इस बिंदु पर देखा जा सकता है. भ्रूण 2 DPF से myofibers और बाद में धारीदार और लम्बी कोशिकाओं (चित्रा 1) के रूप में देखा जाएगा. इस बिंदु पर, myofibers अब लाइव विश्लेषण के लिए या immunolabeling के लिए तैयार हैं.

7 नोट: भ्रूण DPF 1 से कंकाल की मांसपेशी के रूप में लम्बी और स्पष्ट रूप से धारीदार फाइबर प्लेट नहीं है. इसके बजाय, बड़े myoballs दिखाई दे रहे हैं. इसके अलावा, pelleting चरण पद हदबंदी के दौरान myoballs एक गोली को प्राप्त करने के लिए 5000 XG पर 8 मिनट की एक न्यूनतम के लिए centrifuged करने की आवश्यकता है 1 DPF, (2.6 कदम). इस चरण में भ्रूण के विश्लेषण के लिए, यह विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशी 23 में EGFP व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. यह अन्य स्रोतों की तुलना में पेशी मूल से कोशिकाओं की पहचान की अनुमति होगी.

3. Dissociated Zebrafish myofibers के प्रतिदीप्ति immunostaining (टाइम: लगभग 1 दिन)

3.1. Immunolabeling

  1. के एक हिस्से को निकालेंलेपित coverslip का पालन myofibers से मीडिया
  2. 4% paraformaldehyde या मेथनॉल का उपयोग कोशिकाओं को ठीक करें. पीएफए ​​के लिए, मीडिया की मात्रा साढ़े हटाने और पीएफए ​​की एक ही राशि के साथ बदलें. , कुल मात्रा को हटा दें तो, आरटी पर 10 मिनट के लिए फिक्स पीएफए ​​के 50-100 μl के साथ की जगह है, और एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए तय कर लो. शराब निर्धारण, बर्फ ठंड मेथनॉल या एसीटोन के लिए क्रमश: 10 मिनट या 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लागू किया जा सकता है.
  3. Myofibers कम से कम 1x पीबीएस या 1x पीबीएस के साथ 3-5X प्लस 0.1% बीच धो लें. औसत धोने मात्रा coverslip प्रति 50-100 μl है.
  4. Myofibers का हल (शेयर) काम अवरुद्ध जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20-60 मिनट सेते हैं. अवरुद्ध समाधान प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के आधार पर अलग अलग होंगे. प्रयोगशाला में इस्तेमाल दो सबसे आम (1) 1x पीबीएस, 2 मिलीग्राम / एमएल BSA, 1% भेड़ सीरम, 0.25% ट्राइटन X-100 अंतिम और (2) 0.2% ट्राइटन X-100, 2 मिलीग्राम / एमएल (हैं 0.2 % बीएसए) और 5% भेड़ / बकरी सीरम.
  5. अवरुद्ध समाधान निकालें और बी दोनों में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ेंसमाधान या पीबीएस ताला लगा. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात myofibers सेते Parafilm या तो सुनिश्चित करें कि या एंटीबॉडी के साथ लेपित myofiber लोड coverslips युक्त पेट्री डिश लपेट सरन में लपेटो. सिक्त कागज तौलिया के छोटे टुकड़े एक humidified कक्ष बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है.
  6. Coverslips से प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और 5 पीबीएस के साथ मिनट या अवरुद्ध समाधान के लिए coverslips 3-5X धोने.
  7. 1x पीबीएस या आरटी पर 1-2 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में पतला उपयुक्त एकाग्रता में माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें.
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और आरटी पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में myofibers 3-5X धोने.

3.2. बढ़ते coverslips

  1. एक खुर्दबीन स्लाइड पर antifade अभिकर्मक की 1-2 बूँदें लागू करें.
  2. ध्यान से पिकअप लेपित और immunolabled coverslip खुर्दबीन स्लाइड पर antifade अभिकर्मक पर coverslip (myofibers नीचे) संदंश और जगह का उपयोग कर.

सी के उन्मुखीकरण के लिए ध्यान दें: 1 नोटoated coverslip महत्वपूर्ण है.

  1. एक कठिन ठोस सतह पर 1-2 Kimwipes निर्धारित करना. जल्दी antifade अभिकर्मक पर आराम लेपित coverslips साथ स्लाइड पलटना और Kimwipes पर (नीचे coverslip) जगह है.
  2. अतिरिक्त antifade हटाने और स्लाइड और coverslip के बीच एक तंग सील के लिए फार्म खुर्दबीन स्लाइड के कोनों को प्रकाश दबाव लागू करें
  3. आरटी पर 5-10 मिनट के लिए शुष्क करने की शेष antifade, तो myofibers 4 डिग्री सेल्सियस पर (आंकड़े 2A और बी) या दुकान छवि के लिए तैयार हैं अनुमति दें

4. GCaMP3 का प्रयोग लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग

लाइव सेल प्रयोगों (2.10 कदम के बाद) पूर्व निर्धारण करने myofibers पर प्रदर्शन किया जा सकता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल GCaMP3 24, कंकाल की मांसपेशी विशिष्ट zebrafish α actin के प्रमोटर (pSKM) 23 द्वारा व्यक्त एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक, व्यक्त myofibers में रहते इमेजिंग का वर्णन करता है. वैकल्पिक रूप से,इस तकनीक को आसानी से इस तरह के Fura-2 के रूप में कैल्शियम सूचक रंगों का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

  1. PSKM साथ भ्रूण इंजेक्षन: GCaMP3 1-2 सेल स्तर पर निर्माण
  2. 3 DPF पर, लार्वा को इकट्ठा करने और वर्गों 1 और 2 में वर्णित के रूप में myofibers तैयार करते हैं. Myofibers 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए पालन करने की अनुमति. इस तकनीक के लिए, 24 अच्छी तरह से बर्तन में तैयारी coverslips आवश्यक है.
  3. ध्यान से किसी भी अतिरिक्त मीडिया को हटाने, और आरटी पर ताजा सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया के 300 μl जोड़ें.
  4. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें. GCaMP3 सकारात्मक myofibers हरी प्रतिदीप्ति के तहत दिखाई जानी चाहिए.
  5. अगर वांछित, रिकॉर्डिंग के लिए कैमरे की स्थापना की.
  6. सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया में 30 मिमी कैफीन समाधान तैयार करें. कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, धीरे वृद्धि के तहत कुएं में कैफीन समाधान के 300 μl विंदुक. 5-10 सेकंड के भीतर, GCaMP सकारात्मक myofibers प्रतिदीप्ति में तेजी से वृद्धि (चित्रा 3) के साथ कैफीन का जवाब चाहिए. Myofibनेताओं को भी अनुबंध कर सकते हैं. ध्यान से, कैफीन sarcoplasmic जालिका भंडार 25 से कैल्शियम रिहाई लाती है. ऐसे KCl 26 और ryanodine 4 के रूप में अन्य एजेंटों, inducible कैल्शियम रिहाई का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

Myofibers के फ्लोरोसेंट immunolabeling (चित्रा 2)

Myofibers से उम्मीद फ्लोरोसेंट लेबलिंग पैटर्न दिखा छवियों सफल अलगाव और चढ़ाना के बाद immunostained. myofibers विरोधी ryanodine रिसेप्टर (1:100) (2A चित्रा) या विरोधी α-actinin (1:100) (चित्रा 2 बी) एंटीबॉडी के साथ या तो लेबल, और क्रमशः त्रय और Z-बैंड के immunostaining प्रकट किया गया है. इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा Fluor 555 (1:500) थे. छवियाँ confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिया.

एक myofiber से प्रेरित कैल्शियम रिहाई (चित्रा 3)

कैफीन के साथ इलाज के लिए एक अलग myofiber से प्रतिनिधि कैल्शियम रिहाई दिखा पैनल श्रृंखला. संक्षेप में, zebrafish भ्रूण pSKM साथ एक सेल चरण में इंजेक्ट किया गया: GCaMP3 निर्माण. जनसंपर्क में वर्णित के रूप में 3 DPF पर, भ्रूण अलग और चढ़ाया गयाotocol. बेस लाइन पर हरी प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के संकेत के रूप में विश्लेषण के लिए, GCaMP3 व्यक्त myofibers, चयन किया गया था. दवा प्रशासन के लिए एक micropipette का उपयोग करना, चयनित फाइबर कैल्शियम रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए एक 30 मिमी कैफीन समाधान में नहाया था. वीडियो रिकॉर्डिंग से पहले कैफीन आवेदन करना शुरू कर दिया और शिखर प्रतिदीप्ति पहुँच गया था जब तक जारी रखा गया था. यह आंकड़ा सामान्य कैफीन प्रेरित कैल्शियम रिहाई को दर्शाता है, और तकनीक रहते इमेजिंग के माध्यम से उत्तेजना संकुचन युग्मन तंत्र से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. हदबंदी के लिए भ्रूण के भ्रूण हदबंदी के लिए आवश्यक भ्रूण हदबंदी के योजनाबद्ध समय. के बाद एक पैनल (ऊपर से नीचे) अलग अलग चरणों को वर्णन, समय, और उपकरण. ए) चयन. स्केल बार 500 माइक्रोन. बी) मैंहदबंदी सेटअप का दाना. .. दौर coverslips या 24 अच्छी तरह प्लेटें (प्रोटोकॉल डी) एक उज्ज्वल क्षेत्र) क्रमश: 1 और 4 दोहराएँ, पर्याप्त दोनों myofiber चढ़ाना तकनीक की (प्रोटोकॉल चरण 2) सी) छवि अलग तक घुमाया जा रहा है, जबकि भ्रूण मीडिया और collagenase में हैं लाइव की छवि पाली एल lysine लेपित coverslips पर चढ़ाया zebrafish myofibers अलग. तीर 48 HPF zebrafish से लम्बी myofibers निरूपित. स्केल बार 30 माइक्रोन.

चित्रा 2
चित्रा 2. 48 HPF zebrafish भ्रूण से अलग व्यक्ति myofibers के immunolabeling. ए) myofiber विरोधी ryanodine रिसेप्टर (RyR1) के साथ लेबल, त्रय / चुनाव आयोग युग्मन तंत्र. बी) के स्थानीयकरण के साथ संगत फाइबर के साथ एक बंधी पैटर्न खुलासा myofiber विरोधी α के साथ लेबल -actinin, visualizin sarcomere लिए स्थानीयकृत और जेड बैंड पर प्रकाश डाला myofiber साथ जी स्त्रिअतिओन्स (लाल). दोनों चित्र में, नाभिक, DAPI के साथ लेबल रहे नीले अंडाकार रूप में देखा. इंसर्ट बड़ी छवि. ए) और बी) पैमाने बार 30 माइक्रोन में myofiber के उच्च बढ़ाई छवियों को दिखाने के.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि एक अलग zebrafish myofiber से कैल्शियम रिहाई प्रतिक्रिया प्रेरित किया. सभी पैनलों GCaMP3 व्यक्त pseudocolored zebrafish myofiber दिखा. समय के पाठ्यक्रम में 30 मिमी कैफीन के आवेदन के जवाब में GCaMP3 प्रतिदीप्ति (लाल रंग) की वृद्धि दर्शाता है. रिकॉर्डिंग से पहले कैफीन आवेदन (0 मिसे) शुरू कर दिया और अधिकतम प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया (992 मिसे) के लिए जारी रखा. स्केल बार 30 माइक्रोन.एन.के. "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Zebrafish विवो 25,27,28 में मांसपेशियों के विकास और समारोह के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली हड्डीवाला मॉडल प्रणाली रहे हैं. उन्होंने यह भी मानव मांसपेशियों की बीमारियों 14,15,20,29 मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान संपत्ति के रूप में उभरा है. उल्लेखनीय प्रगति की मांसपेशी समारोह और मांसपेशियों की बीमारी के अध्ययन के लिए zebrafish का उपयोग और आवेदन करने के लिए अग्रिम ले लिया गया है जबकि, व्यवहार और कार्यात्मक आनुवंशिक, शब्द के भागों, कि प्रशंसा और अधिक गहराई में विश्लेषण की अनुमति देगा कि उपकरण को विकसित करने के लिए एक निरंतर महत्वपूर्ण जरूरत है फायदे zebrafish पहले से ही 17 की पेशकश. इसलिए हम अनुकूलित और अलग पूरे भ्रूण से zebrafish myofibers के लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और मजबूत तकनीक विकसित की है.

व्यक्तिगत myofibers का उपयोग murine मॉडल प्रणाली का उपयोग अध्ययन में आम है. चूहों में इस पूरे पशुओं में अव्यावहारिक या असंभव है कि जांच और विश्लेषण के लिए अनुमति दी गई है incluडिंग subcellular प्रोटीन स्थानीयकरण 30, जीना सेल इमेजिंग 31, और electrophysiologic माप 32 अध्ययन करता है. Zebrafish में, इसी तरह की हदबंदी तकनीक पहले से विशेष रूप से पहचान करने और motorneurons 33 के साथ ही Rohon-दाढ़ी संवेदी न्यूरॉन्स 34 की जांच करने के लिए विकसित किया गया है, और इन तकनीकों इन न्यूरॉन उपप्रकार के विस्तृत विश्लेषण के लिए सक्षम है.

zebrafish एक हड्डीवाला मॉडल के रूप में 17 प्रदान करता है कई अद्वितीय फायदे के साथ संयुक्त पृथक myofibers के व्यापक प्रयोज्यता, हमें भ्रूण और लार्वा zebrafish myofibers अलग और निस्र्पक के लिए एक तकनीक विकसित करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. हम काल्पनिक रूप से व्यक्त transgenes 35 का स्थानीयकरण अध्ययन करने के लिए और विशेष रूप से आकार सहित विशिष्ट myofiber मानकों को परिभाषित करने के लिए मांसपेशियों में प्रोटीन 20,21 के subcellular स्थानीयकरण, यह निर्धारित करने के लिए पिछले अध्ययनों में अलग myofibers का उपयोग किया है 20,21 की मछली मॉडल के लिए मान्यता का एक स्रोत के रूप में फाइबर का इस्तेमाल किया है. उदाहरण के लिए, हम nemaline मायोपथी 20 के एक मॉडल में Immunofluorescent विश्लेषण द्वारा nemaline निकायों की पहचान की है. हम भी apoptosis और oxidative तनाव 15 सहित विशिष्ट intracellular रास्ते, पूछताछ के एक साधन के रूप में myofibers प्रयोग किया जाता है, और विशिष्ट रासायनिक modulators 15 के आवेदन और परीक्षण के लिए.

GRABNER और उनके सहयोगियों ने भी बड़ी सफलता 19,22,36 को myofiber प्रणाली का इस्तेमाल किया है. वे अलग फाइबर के लंबे समय तक संवर्धन रिपोर्ट करने के लिए ही समूह हैं. इसके अलावा, वे पेशी के electrophysiological गुणों को मापने के लिए फाइबर का उपयोग करने में सक्षम है. विशेष रूप से, वे कैल्शियम रिहाई पर dihydropyridine रिसेप्टर के बीटा सबयूनिट की हानि के प्रभाव का परीक्षण किया और टॉवर बचाव के लिए transgenes का एक सेट की क्षमता मापा हैइस रिलीज में सीटीएस. इन अध्ययनों से अलग myofibers के बहुत शक्तिशाली संभावित आवेदनों में से कुछ को उजागर करना.

मांसपेशियों की बीमारी के अध्ययन के लिए myofiber प्रस्तुत करने का उपयोग रिपोर्ट करने के लिए एक अन्य समूह मांसपेशियों के विकास और मांसपेशियों की संरचना पर 18 morpholino मध्यस्थता caveolin 3 पछाड़ना के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए myofibers इस्तेमाल किया जो निक्सन एट अल. है. इन लेखकों प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मापदंडों की जांच की, लेकिन यह भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग फाइबर का अध्ययन किया ही नहीं. एक अलग और नियंत्रण स्थापित करने में myofiber के फैटी अध्ययन करने की क्षमता: उनके काम अलग myofiber प्रणाली का एक और लाभ यह पहचानती है.

ये अध्ययन, इस तकनीक के संभावित व्यापक उपयोगिता के लिए हमारे काम, बिंदु के साथ. अतिरिक्त आवेदन ऐसे Fura-2 जैसे संकेतकों का उपयोग तेजी से कैल्शियम spikes मापने के रूप में विकसित किया जाना तय है. साथ ही, यह तैयारी obser करने का अवसर प्रदान करता हैऐसे वोल्टेज संवेदनशील रंगों (Di-4-ANEPPS) या प्रत्यक्ष electrophysiological रिकॉर्डिंग के माध्यम से कार्रवाई की क्षमता के रूप में बिजली की गतिविधि, ve. यह murine myofibers पर इस्तेमाल सभी मौजूदा तकनीकों zebrafish myofibers के लिए लागू किया जाना चाहिए कि स्पष्ट लगता है. इसके अलावा, विकासशील zebrafish में अलग transgenes व्यक्त, साथ ही साथ (विभिन्न मार्कर प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक zebrafish की एक बड़ी और बढ़ती संख्या की उपलब्धता के लिए क्षमता www.zfin.org ), जटिलता और प्रयोज्यता की एक और परत कहते हैं प्रणाली. हम (चित्रा 3) पृथक फाइबर में वास्तविक समय में प्रेरित कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन करने के लिए मांसपेशियों में GCaMP3 व्यक्त करने की क्षमता का लाभ ले जहां GCaMP3 व्यक्त zebrafish से संवर्धित myofibers के साथ इस तथ्य को प्रदर्शित करता है.

सबसे तकनीक के साथ के रूप में, अलग myofiber व्यवस्था करने के लिए कुछ स्पष्ट सीमाएं भी हैं. इन मुद्दों पर स्टैंड के अलावा हैंइन विट्रो में एक सेल प्रकार का अध्ययन करने के एआरडी कमियों कि vivo में एक तीन आयामी syncytia के रूप में और nonphysiologic उत्तेजनाओं के साथ electrophysiologic प्रयोगों प्रदर्शन का कार्य करता है. हमारी पद्धति का प्रयोग, एक myofibers का शुद्ध तैयारी प्राप्त करने में सक्षम नहीं है. इस immunostaining के लिए या electrophysiological माप के लिए एक समस्या नहीं है, लेकिन यह निश्चित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण रोकता है. उदाहरण के लिए, हम transcriptomic विश्लेषण के लिए myofibers के एक शुद्ध आबादी की पहचान करने के लिए एक उपयुक्त पद्धति को निर्धारित करने के लिए अभी तक है. हम myofiber तैयारी द्वारा पीछा GFP व्यक्त myofibers के FACS छँटाई का प्रयास किया है, लेकिन इस शाही सेना या प्रोटीन विश्लेषण के लिए या तो myofibers का एक उपयुक्त संख्या के साथ एक शुद्ध संस्कृति में नहीं हुई है.

एक और चुनौती myofibers के दीर्घकालिक संवर्धन है. हम लगभग 24 घंटे के लिए संस्कृतियों रखने के लिए सक्षम किया गया है, और GRABNER और उनके सहयोगियों Suita किया गया है कि एक तैयारी रिपोर्टप्रयोग 19 से अधिक दिनों के लिए ble. (ज्यादा murine myofiber preps) की तरह इन संस्कृतियों अक्सर बाँझ रखने के लिए मुश्किल हो जाता है के रूप में तकनीक के इस पहलू से संबंधित चुनौती, संदूषण रोकने है. एक लंबे समय तक संस्कृतियों का प्रयास करने के लिए है, तो महान देखभाल की जरूरत है. हम भी एंटीफंगल सहित antimicrobials का उपयोग करें.

सभी में, हम zebrafish myofibers के अलगाव के साथ ही अलग - अलग फाइबर तैयारियों पर फ्लोरोसेंट immunolabeling और वास्तविक समय कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए रूपरेखा के लिए एक व्यावहारिक विधि का प्रदर्शन. इस तकनीक की सतत संशोधन और विकास zebrafish में विशिष्ट, अलग प्रकार की कोशिकाओं पर प्रयोग करने के लिए उपकरणों की एक कभी विस्तार के प्रदर्शनों की सूची की पेशकश करेगा. पृथक व्यक्तिगत myofibers में zebrafish भ्रूण अलग कर करके, हम आगे की मांसपेशी विकास, समारोह और रोग के बारे में हमारी समझ को बढ़ा सकते हैं.

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Disclosures

लेखक कोई परस्पर विरोधी हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों तकनीक के विकास के लिए और पांडुलिपि के उत्पादन के लिए योगदान दिया है कि दोव्लिंग प्रयोगशाला के सदस्यों (हारून Reifler, ट्रेंट वॉ, एंजेला गाया, और विलियम Telfer) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम Taubman संस्थान, मिशिगन विश्वविद्यालय में बाल रोग विभाग, और पेशी Dystrophy एसोसिएशन (JJD MDA186999) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (JJD 1K08AR054835) से अनुदान से भाग में द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well culture plate Corning 3524
10x PBS Invitrogen Gibco 70011
CO2 Independent medium Invitrogen Gibco 18045
Collagenase Type II Worthington Biochemical LS004186 Lot 41H12764
Collagenase Type IV Worthington Biochemical L5004188
8% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8
Methanol Sigma 322415
Triton X-100 Sigma X100
BSA Sigma A2153
Sheep serum Sigma S3772
Goat serum Sigma G9023
Glass coverslips Fischerbrand 12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine Sigma P4707
Pronase Sigma P5147
40 μm Filter BD Biosciences 352340
70 μm Filter BD Biosciences 352350
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36931
Anti-α-Actinin antibody Sigma A5044
Anti-RYR antibody Abcam 34C
Alexa Fluor antibody Invitrogen A-21425
TWEEN 20 Sigma P1379
60 mm Petri dish Fischerbrand 0875713A
Poly-L-Ornithine Sigma P4957
Microscope slide Fischerbrand 12-550-15
Caffeine Sigma C0750

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 81 zebrafish neuromuscular रोग पेशी रोग पेशी अपविकास प्राथमिक सेल संस्कृति immunohistochemistry (आईएचसी) कंकाल की मांसपेशी myofiber लाइव इमेजिंग
अलग तैयारी से भ्रूण और लार्वा zebrafish कंकाल myofibers का विश्लेषण
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Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li,… More

Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations. J. Vis. Exp. (81), e50259, doi:10.3791/50259 (2013).

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