Summary
نحن تصف بروتوكول لعزل وتنقية العدلات من نخاع العظم الماوس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة والعدلة لوضع العلامات باستخدام الأصباغ CellTracker. وهذا يمثل طريقة بسيطة وسريعة واستنساخه واقتصادية من أجل الحصول على أعداد كبيرة من العدلات للدراسات وظيفية المصب أو نقل وتتبع التجارب بالتبني.
Abstract
العدلات هي خلايا المستجيب الحرجة من نظام المناعة الفطرية. يتم تجنيدهم بسرعة في مواقع الالتهاب الحاد وبذل آثار وقائية أو المسببة للأمراض اعتمادا على الوسط التهابات. ومع ذلك، على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في الحصانة، فهم مفصل من العوامل الجزيئية التي تتوسط الآثار العدلات 'المستجيب وimmunopathogenic في الأمراض المعدية المختلفة والحالات الالتهابية لا يزال غير موجود، وذلك جزئيا بسبب وضعهم قصيرة نصف الحياة، وصعوبات في التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق بها للحصول على أعداد كافية من العدلات للدراسات وظيفية المصب وتجارب نقل بالتبني. ولذلك، طرق بسيطة وسريعة واقتصادية وموثوق بها، مطلوبة بكثرة لحصاد أعداد كافية من العدلات الماوس لتقييم وظائف مثل البلعمة والقتل، خلوى الإنتاج، وتحبب والاتجار بها. وتحقيقا لهذه الغاية،نقدم كثافة بروتوكول التدرج استنساخه القائم على الطرد المركزي، والتي يمكن تكييفها في أي مختبر لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وقدرتها على البقاء. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم بروتوكول بسيط يستخدم الأصباغ CellTracker لتسمية العدلات المعزولة، والتي يمكن بعد ذلك يتم نقل adoptively في الفئران المتلقية وتعقبها في العديد من الأنسجة لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل باستخدام التدفق الخلوي. باستخدام هذا النهج، ووضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص مع الأصباغ CellTracker مختلفة يمكن استخدامها بنجاح لإجراء دراسات إعادة تعمير تنافسية لتقييم الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الأنسجة المستهدفة في الجسم الحي .
Introduction
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في البشر. هم المكون الرئيسي الخلوية في الجهاز المناعي الفطري ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. المرضى الذين يعانون من قلة العدلات المكتسبة ونقص المناعة الأولية التي تؤثر على أعداد العدلات و / أو وظيفة تطوير التهابات الغازية التي تهدد الحياة البكتيرية والفطرية، وتسليط الضوء على أهمية هذه الخلايا في الدفاع المضيف 1. الاعتراف المناعي للغزو مسببات الأمراض في موقع الإصابة بهم وما شابه ذلك نمط الاعتراف مستقبلات النتائج في الاستقراء لمدبرة الاستجابة المناعية الفطرية، الأمر الذي يؤدي إلى إفراز chemoattractants التي تولد التدرج الكيميائي قادرة على تجنيد العدلات من مجرى الدم إلى الأنسجة الملتهبة 2 . بعد العدلات دخول موقع الإصابة، فإنها تصبح تفعيلها، الأمر الذي يؤدي إلى خلوى وchemokine الإنتاج، وامتصاص الممرض، وقتل عن طريق الأكسدة وغير المؤكسدة ليchanisms 3. وإلى جانب دورها المعترف بها بشكل جيد في المناعة الفطرية، كما تم مؤخرا أظهرت العدلات للعب أدوار هامة مثل المبادرين من الاستجابات المناعية التكيفية فعالة 4. من ناحية أخرى، وبصرف النظر عن الأدوار وقائي بهم في الحصانة، العدلات قد توسط أيضا إصابة الأنسجة والباثولوجيا المناعية بسبب التراكم المفرط و / أو التنشيط في مواقع الالتهاب، كما هو مبين في مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية والمناعة الذاتية 5-7.
على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في تصاعد الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة ووظائفها المستجيب عديد المظاهر في العديد من الأمراض المعدية والالتهابات، والصعوبات التقنية مع التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق أعاق البحوث مع العدلات على مدى العقود الماضية. ولذلك، واستخدام المقايسات استنساخه لعزل العدلات ينبغي أن تسهل إجراء المزيد من البحوث على immunolo العدلات بوساطةوظائف gical خارج الحي والحية. حتى الآن، وقد وصفت عدة طرق لعزل العدلات مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة من الدم البشري والدم الماوس أو نخاع العظم 8،9، إيجابية أو سلبية تخصيب immunomagnetic من العدلات من الدم أو نخاع العظم الماوس 10،11، والحصاد من العدلات من التجويف البريتوني من الفئران بعد الحقن داخل الصفاق من thioglycollate أو وكلاء الالتهابية الأخرى 12. على الرغم من العدلات يمكن عزلها بسهولة في أعداد كبيرة من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو الأمثل في الفئران نظرا لمحدودية حجم الدم الماوس يحول دون العزلة من العدلات كافية للدراسات وظيفية أو تجارب نقل بالتبني 13. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العائد من thioglycollate-أثارت الخلايا من التجويف البريتوني هو أكبر مقارنة بما كان عليه من الدم الماوس، ونقاء من العدلات في غسيل البريتوني التهابات يختلف بين60-90٪، والعدلات معزولة يحمل النمط الظاهري تفعيلها. وهكذا، جمع الخلايا باستخدام هذا الأسلوب يمكن فقط أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية للتنشيط ولكن ليس من العدلات unstimulated، كما التجويف البريتوني الماوس لديها عدد قليل العدلات في حالة مستقرة 12. بدلا من ذلك، نخاع العظم هو خزان مريحة للحصاد أعداد كبيرة من العدلات إما unstimulated أو تنشيط 11،14، والتي يمكن ان تستخدم بعد ذلك لدراسات وظيفية المصب مثل البلعمة والقتل وتحبب، أو لنقل بالتبني في الفئران المتلقية.
هنا نحن تصف بسيطة وسريعة (~ 2 ساعة) البروتوكول، الذي يوفر العائد المرتفع (~ 6-12 × 10 6 العدلات / الماوس غير مصاب، أو ما يصل إلى 30-40 × 10 6 العدلات / فأر مصاب) من الذهب الخالص (80 -95٪) العدلات مع> 95٪ الجدوى من نخاع العظام. يستخدم هذا الأسلوب Histopaque المتاحة تجاريا، والتي هي كثافة التدرج سيبا الخليةوسائل الاعلام التموينية تتألف من Ficoll ودياتريزوات الصوديوم، لفصل العدلات من نخاع العظام من الفئران. هذه الطريقة تعطي أرقام أكبر بكثير من العدلات في الماوس مقارنة مع الدم أو البريتوني تجويف، فإنه يمكن استخدامها لجمع العدلات من الفئران سواء في حالة مستقرة أو بعد الإصابة، وأنه من الأسهل أن طبقة بالمقارنة مع أسلوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة التي تستخدم متقطع التدرجات Percoll تتألف من 55٪ / 65٪ / 75٪ Percoll في برنامج تلفزيوني 9. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تناقص الوقت والموارد اللازمة لجمع العدلات نقية بشكل ملحوظ مقارنة مع العزلة العدلة باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا. أيضا، لأن هذا الأسلوب لا ينطوي على خطوة تخصيب immunomagnetic، هو أكثر فعالية من حيث التكلفة، وأنه يتجنب التعرض الخلايا إلى العمود المغناطيسي والأجسام المضادة، مما يخفض من احتمال تفعيل العدلات.
بالإضافة إلى إجراء الدراسات الفنية للneutroph معزولةILS خارج الحي ونقل بالتبني من الخلايا في الفئران المتلقية، ويصف هذا البروتوكول أيضا طريقة لوصفها من العدلات المعزولة باستخدام الأصباغ CellTracker مختلفة. وضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من مختلف الخلفيات الوراثية يمكن تكييفها في دراسات إعادة تعمير تنافسية لتتبع العدلات نقل في أنسجة الفئران المتلقي باستخدام التدفق الخلوي، والتي يمكن أن توفر البصيرة الآلي على الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الهدف أجهزة ملتهبة 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. العزلة من الفأر نخاع العظم والخلايا
- الموت ببطء الفئران باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان المؤسسة اللجنة وافقت عليها وترش على سطح الحيوان مع الايثانول 70٪.
- إجراء شق في الجلد في منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء القاصي من الفأرة بما في ذلك الجلد الذي يغطي السفلية.
- قطع العضلات من السفلية باستخدام مقص وخلخل بعناية لحق من مفصل الورك، مع تجنب كسر عظم الفخذ رئيس.
- إزالة العضلات المتبقية من عظم الفخذ والساق باستخدام مشرط ومقص وفصل عظم الفخذ من الساق عند الركبة الرعاية ممارسة مشتركة لعدم كسر نهايات العظام. وضع العظام في طبق بتري تحتوي RPMI الجليد الباردة 1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.
- انتقل إلى الخطوات التالية في إطار نسيج الثقافة هود. اتخاذ الاحتياطات اضافية للحفاظ على تقنيات معقمة صارمة لتجنب neutrophiL التنشيط.
- شطف كل العظام مع الايثانول 70٪ (داخل طبق بتري)، يليه ثلاثة يغسل اللاحقة في الجليد الباردة PBS العقيمة (داخل أطباق بتري) لشطف قبالة الإيثانول من سطح العظام.
- في الداخل نظيفة طبق بتري معقمة، وقطع المشاش في العظام والاحتفاظ بها جانبا.
- استخدام إبرة عيار 25 وحقنة سم مكعب 12 مليئة RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و 2 ملي EDTA، وتدفق خلايا نخاع العظام من كلا طرفي مهاوي العظام على 50 مل المسمار أعلى أنبوب فالكون مزودة 100 ميكرون تحديد. من أجل إزالة جميع الخلايا بكفاءة، كشط السطح الداخلي للعظام باستخدام إبرة عيار 25.
ملاحظة: ابيضاض من العظام يشير إلى أن خلايا تم كشط بما فيه الكفاية.
ملاحظة: استخدم حوالي 10 مل من وسائل الاعلام لطرد عظم فخذ / الزوج الساق. مضيفا EDTA إلى وسيلة ضرورية لمنع تراكمها من الخلايا.
- قطع المشاش العظامفي الصغيرة 0.5-1 ملم 3 قطع مع مشرط وسحق لهم من خلال مرشح ميكرون 100 باستخدام نهاية الخلفي من 2.5 مل إيبندورف Combitip زائد بيوبور غيض ماصة.
- الطرد المركزي في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق الخلية بيليه في 20 مل من 0.2٪ كلوريد الصوديوم لحوالي 20 ثانية تليها إضافة 20 مل من 1.6٪ كلوريد الصوديوم. (الحرجة: لا يتجاوز 20-30 ثانية من تحلل منخفض التوتر لتجنب موت الخلايا نخاع العظام ينصح استخدام ناقص التوتر كلوريد الصوديوم لتحلل أكثر من العازلة lysing ACK لأن الأخير لديه القدرة على تفعيل العدلات).
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 1،400 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لجمع الخلايا.
- غسل الخلايا مع المتوسط 1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 2 ملي EDTA وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.12.
- العائد من خلايا نخاع العظام باستخدام هذا الأسلوب هو ما يقرب من 60 حتي 80000000 في المعافين C57BL 8-12 أسبوع من العمر / 6 الماوس.
2. فصل من العدلاتبواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة
- عد خلايا نخاع العظم و resuspend في 1 مل من الجليد الباردة PBS العقيمة.
- أضف 3 مل من Histopaque 1119 (الكثافة، 1.119 جم / مل) في أنبوب مخروطي 15 مل.
- تراكب 3 مل من Histopaque 1077 (الكثافة، 1.077 جم / مل) على مل 3 من Histopaque 1119.
ملاحظة: Histopaque 1119 وHistopaque 1077 ينبغي أن تكون درجة حرارة إلى 18-26 درجة مئوية قبل الاستخدام.
خطوة حاسمة: إعداد التدرجات فورا قبل الاستخدام وإعداد والتدرج في وقت مبكر يؤدي إلى انتشار بين طبقتين ونقاء العدلة دون المستوى الأمثل والانتعاش.
خطوة حاسمة: تتراكب Histopaque 1077 أكثر من 1119 يحتاج إلى أن يتم ببطء لتجنب خلط اثنين من الكثافة، والتي سوف يحول دون فصل الخلايا خلال الطرد المركزي.
- تراكب خلية نخاع العظم التعليق على الجزء العلوي من Histopaque 1077.
خطوة حاسمة: Overlفي Aying الخلية نخاع العظم التعليق أكثر من 1077 احتياجات Histopaque إلى أن يتم ببطء لتجنب تعكير صفو العلاقة بين الخلايا وHistopaque 1077.
ملاحظة: إعادة التعليق خلايا نخاع العظام من الماوس المعافين في 1 مل من برنامج تلفزيوني تعطي نقاء العدلة من> 90٪. ومع ذلك، وتجميع العديد من عينات نخاع العظام التنازلات نقاء العدلة، على سبيل المثال، إعادة التعليق 300 × 10 6 خلايا في 3 مل PBS يقلل من نقاء العدلات> 90٪ إلى 80٪ ~. ولذلك، ينبغي للمحققين إجراء تجارب رائدة لتحديد العد / حجم الخلية ظروف مثالية لتجاربهم الخاصة
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 2،000 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية دون فرامل.
ملاحظة: الطرد المركزي من التدرج في درجة حرارة الغرفة أمر بالغ الأهمية وضرورية لفصل فعلي من العدلات.
- جمع العدلات في واجهة من Histopaque 1119 وHistopaque 1077 طبقات. غسل العدلات جمعها مرتين مع المتوسط 1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين والطرد المركزي في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- عد العدلات وتحديد قدرتها على الاستمرار.
ملاحظة: العدلات هي عادة> 95٪ قابلة للحياة و> 90٪ نقية على النحو الذي يحدده تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. العائد نموذجي من العدلات من نخاع العظام (أي 2 عظم الفخذ والظنبوب العظام 2) من غير مصاب 8-12 C57BL من العمر الأسبوع / 6 الماوس ~ 6-12٬000٬000 الخلايا. هذا العدد هو أكبر بكثير عندما يتم حصاد العدلات من نخاع العظام من الحيوانات المصابة. وبالتالي، تم انتشال ~ 30-40000000 العدلات / الماوس عندما استخدمت الفئران المصابة المبيضات للحصاد الخلية 6.
3. وضع العلامات من العدلات باستخدام الأصباغ CellTracker
- Resuspend والعدلات في 5 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني prewarmed عند 37 درجة مئوية.
- إضافة صبغة CellTracker في تناسق النهائيالتموينية من 5 ميكرومتر.
ملاحظة: CellTracker الأخضر (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein ثنائي الأسيتات) وCellTracker أورانج (CMTMR (5 - (و-6)-4-كلوروميثيل Tetramethylrhodamine الأمينية بيروكسايد) والمستخدمة في هذا البروتوكول لتسمية تفاضلي العدلات من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص الفئران.
ملاحظة: إعداد محلول المخزون من 10 ملم من الأخضر CellTracker وCellTracker أورانج، قسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى يوم من التجربة.
- احتضان العدلات مع 5 ميكرومتر من الصبغة CellTracker المقابلة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تهتز في الظلام.
- غسل الخلايا مرتين مع الثلج الباردة المتوسط 1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.
ملاحظة: غسل كفاءة من الخلايا بعد خطوة وصفها مع صبغ CellTracker أمر ضروري لتجنب صبغ انتقال التلوث قبل خلط السكان العدلة تفاضلي المسمى لهبوطاtream دراسات إعادة تعمير تنافسية.
4. نقل بالتبني من العدلات في الفئران والتحليل من العدلات المحول باستخدام التدفق الخلوي
- العدلات resuspend في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة عند تركيز 25 × 10 6 خلية / مل وحقن 200 ميكرولتر من تعليق في الوريد الذيل الأفقي بحيث يتم نقل 5 × 10 6 العدلات في الماوس. للدراسات العدلة إعادة تعمير تنافسية، مزيج العدلات من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص في نسبة 1:1 وحقن ما مجموعه 5 × 10 6 العدلات في الماوس على النحو الوارد أعلاه.
ملاحظة: على الأقل ما يصل إلى 10 × 10 6 العدلات يجوز نقل adoptively في الماوس دون سمية فوري واضح لهذه الحيوانات.
- في أوقات مختلفة بعد نقل بالتبني (على سبيل المثال 1، 2، 3 أو 4 ساعات بعد نقل)، الموت ببطء الفئران والدم الحصاد، و / أو نخاع العظم و / أو غيرها من الجهاز المستهدف (ق) من الفائدة.
- إعداد سيتعليق خلية ngle من هذه الأنسجة للتحليل الكمي والنوعي للنقل adoptively العدلات المسمى باستخدام بروتوكولات نشرت 6،15.
- بعد لايف / الميت تلطيخ الجدوى والحصار اف سي، خلايا التسمية مع CD45 (استنساخ 30-F11)، Ly6G (استنساخ 1A8) وCD11b (استنساخ M1/70) وبوابة لايف CD45 + Ly6G + + CD11b العدلات. العدلات في هذه البوابة تشمل العدلات مواطن من الماوس المتلقي فضلا عن العدلات المسمى نقل adoptively، والتي هي + FITC (إذا كان المسمى مع CellTracker الأخضر) أو PE + (إذا كان المسمى مع خلية المقتفي أورانج).
ملاحظة: قد يتم تعقب العدلات في الدم ونخاع العظام والكلى من الفئران المصابة المبيضات لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل.
ملاحظة: التثبيت مع بارافورمالدهيد 2٪ في برنامج تلفزيوني لا يؤثر سلبا على كثافة مضان يعني من العدلات المسمى مع غرام CellTrackerالتابعين أو CellTracker البرتقال لمدة 48 ساعة على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هو الأمثل هذا البروتوكول بالنسبة للمحصول من خلايا نخاع العظام من الفئران وفصل لاحق من العدلات من هذه الخلايا بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام المتاحة تجاريا وسائل الاعلام فصل الخلية Histopaque. عزل العدلات باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من المصب دراسات وظيفية خارج الحي وللتجارب نقل بالتبني في الفئران المتلقية.
العائد نموذجي من مجموعة من خلايا نخاع العظام من عظام الفخذ والساق على حد سواء في المعافين 8-12 C57BL من العمر الأسبوع / 6 الماوس ~ 60-80000000 الخلايا مع بقاء ~ 94-98٪. المصب الطرد المركزي المتدرج الكثافة من هذه الخلايا باستخدام وسائل الاعلام فصل كثافة Histopaque ينتج عادة ~ 6-12٬000٬000 العدلات في الماوس المعافين. العدلات هي 80-95٪ نقية و> 95٪ قابلة للحياة، كما تم التحقق منها من قبل التدفق الخلوي (الشكل 1). على الرغم من أنه من الممكن أن تجمع خلايا نخاع العظام من العديد من الحيوانات قبل كثافةالتدرج خطوة الطرد المركزي، وخلايا تجميع يقلل قليلا على نقاء العدلات معزولة. على سبيل المثال، في حين تتراكب 60-80000000 خلايا نخاع العظام من الماوس غير مصاب واحد في 1-3 مل من عوائد PBS> 90٪ العدلات نقية، نقاء الخلية تنخفض إلى 80٪ ~ عندما يتم تجميع ~ 300 مليون خلايا نخاع العظام معا في 3 مل من برنامج تلفزيوني ومتراكبة.
وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول أيضا الخطوات من أجل وضع العلامات اللاحقة من العدلات مع الأصباغ CellTracker، والذي يسمح لتتبع الخلايا نقل adoptively في الفئران المتلقية باستخدام التدفق الخلوي. وضع العلامات من العدلات مع 5 ميكرومتر من CMFDA أو CMTMR لا يبدو أن تؤثر على بقاء العدلة كما تبقى العدلات صفت> 95٪ قابلة للحياة (لا تظهر البيانات). ويمكن تعقب العدلات المسمى في الأنسجة المختلفة الماوس لمدة 4 ساعة على الأقل بعد نقل بالتبني باستخدام التدفق الخلوي بواسطة النابضة الحية على CD45 + + Ly6G CD11b + الخلايا (الشكل 2).استخدام الأصباغ وضع العلامات الفرق في العدلات من النوع البري مقابل الجينات التي تعاني من نقص في دراسات إعادة تعمير تنافسية يسمح لتقييم الدور المباشر من جين معين (مثل مستقبلات جاذب كيميائي 6) في الاتجار العدلات من الدم إلى جهاز هدف معين.
الشكل 1. ممثل FACS مؤامرة من العدلات معزولة من خلايا نخاع العظام من C57BL المعافين / 6 الماوس باستخدام بروتوكول الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يوضح اللوحة اليسرى وتبوب الأولية المستخدمة في خلايا نخاع العظام التي تم جمعها من واجهة من Histopaque 1119 وHistopaque 1077 باستخدام الأمام و الجانب مبعثر (FSC / SSC). كما هو مبين، العدلات التي تم جمعها من واجهة هي> 90٪ نقية (لوحة الأوسط) و> 95٪ (اللوحة اليمنى) قابلة للحياة.
<IMG بديل = "الشكل 2" SRC = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
الشكل 2. ممثل FACS مؤامرة من نقل adoptively CMTMR المسمى العدلات تحصد من الدم ونخاع العظام والكلى لمستلم المبيضات المصابة C57BL / 6 الماوس 4 ساعة نقل الخلية التالية. ونقل adoptively العدلات CMTMR المسمى هي PE-الإيجابية ويمكن أن تكون متباينة من العدلات مواطن من الماوس المتلقي، والتي هي PE-سلبية. لاحظ أن التعبير عن CD11b أكبر في العدلات تحصد من الكلى مقارنة العدلات تحصد من الدم ونخاع العظام. الزيادة في التعبير CD11b في العدلات الكلى يتسق مع النتائج السابقة 15 والمرجح يعكس تفعيل الخلايا عند الدخول في الكلى، والذي هو العضو المستهدف الرئيسي في نموذج الفأر من المبيضات النظامية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم بروتوكول موثوق بها، بسيطة، سريعة واقتصادية لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وجدوى استخدام نهج الطرد المركزي المتدرج الكثافة. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، يمكن استردادها ~ 6-12 × 10 6 العدلات من الماوس المعافين وما يصل الى ~ 30-40 × 10 6 العدلات قد تكون معزولة عن ماوس بعد الإصابة 6. العدلات معزولة هي 80-95٪ نقية و> 95٪ قابلة للحياة.
نخاع العظم هو الخزان مناسبة للحصول على العدلات الماوس للدراسات وظيفية المصب وتجارب نقل بالتبني. أولا، لقد ثبت سابقا أن العدلات نخاع العظام متشابهة وظيفيا إلى العدلات الدم في الفئران كما الخلايا من كلا مقصورات يحمل انفجار مماثل التأكسدي وتحبب 16. الثاني، وقد ثبت الماوس العظم العدلات نخاع البقاء على قيد الحياة protrتصرف فترات من الزمن في الثقافة، لفترة أطول كثيرا مقارنة العدلات الدم الماوس 16. ولذلك، حصاد نخاع العظم أكثر من العدلات الدم قد تسمح للمحصول أكبر من الخلايا عند معالجتها لفحوصات وظيفية خارج الحي. الثالث، والعزلة من العدلات من نخاع العظام يوفر ميزة يتعافى أعداد أكبر بكثير من العدلات، والتي هي كافية لالمصب تجارب نقل بالتبني، سواء في حالة مستقرة وبعد الإصابة. بدلا من ذلك، يمكن استردادها أقل بكثير العدلات من الدم الماوس، حتى بعد الإصابة، وليس الكثير من العدلات موجودة في حالة مستقرة في التجويف البريتوني. وبالتالي، يتم استخدام thioglycollate أو غيرها من العوامل عادة لتشجيع توظيف العدلات تفعيلها في الصفاق؛ يعوق هذه المنهجية من قبل نقاء متغير من العدلات ضمن البريتوني الافرازات الالتهابية الحادة (غير منشورة، لا تظهر البيانات) وتحريض على المنشط العدلة phenotypه، والتي تختلف عن تلك التي العدلات unstimulated تعافى من الفئران unmanipulated.
العديد من الأساليب المتاحة لعزل العدلات من نخاع العظام من الفئران. وتشمل هذه (أ) نهج الطرد المركزي المتدرج الكثافة مثل واحد ونحن الحاضرين هنا أن يستخدم وسائل الاعلام فصل كثافة Histopaque، ومنهجية مماثلة يستخدم متقطع التدرجات Percoll 17، (ب) نهج اختيار immunomagnetic إيجابية، حيث وصفت خلايا نخاع العظام مع الأجسام المضادة العدلة محددة مثل Ly6G، والعدلات وثم أثرى ملزم من إيجابية الخلايا Ly6G على عمود المغناطيسي 18، (ج) النهج immunomagnetic اختيار السلبية، التي وصفت خلال خلايا نخاع العظام مع كوكتيل من الأجسام المضادة التي تربط على الخلايا الأخرى من العدلات (أي CD5 لالخلايا اللمفية تي، CD45R/B220 لالخلايا الليمفاوية B، CD49b/DX5 للخلايا NK، CD117 عن الخلايا البدينة والخلايا الجذعية المكونة للدم، F4/80 للالضامة وTer119 لكريات الدم الحمراء) 11، ثم يتم إثراء العدلات من قبل شطف باعتبارها جزء الجسم المضاد سلبية من الخلايا التي لا ربط على عمود المغناطيسي، و (د) الإسفار المنشط الفرز الخلية، التي وصفت خلال خلايا نخاع العظام مع الأجسام المضادة ثم يتم فصل التي تربط على العدلات وخلايا أخرى، والعدلات باستخدام الإسفار المنشط فارز الخليوي والخلايا التي هي إيجابية للعلامات العدلة مثل مزيج من Ly6G وCD11b.
على الرغم من أن كلا النهجين اختيار immunomagnetic إيجابية والإسفار الفرز الخلية المنشط توفر عوائد عالية جدا ودرجات نقاء من العدلات الماوس، وهذه الأساليب لديها عيب مقارنة بروتوكول لدينا أن وكلاء العلامات ربط على سطح العدلات، والتي يحتمل أن تغير وظيفتها. نهج اختيار immunomagnetic ايجابية لديهم قيود إضافية هذا الجسم المضاد المسمى العدلات ربط على عمود المغناطيسي لياليeparation، والتي قد تؤثر أيضا وظيفة الخلية. مضان المنشط الفرز الخلية لديه عيب الإضافية التي يحتاج الأمر إلى وقت أطول بكثير لمجموعة من الخلايا باستخدام الإسفار المنشط فارز خلية في المختبر مرفق الأساسية، والتي قد تؤثر سلبا على البقاء على قيد الحياة من العدلات وترجع الزيادة إلى نصف حياة قصيرة. لدينا طريقة مماثلة لطريقة الطرد المركزي المتدرج الكثافة التي تستخدم التدرجات Percoll متقطع، ولكن طبقات اثنين من وسائل الاعلام فصل كثافة Histopaque هو أقل بكثير من الناحية الفنية تحدي مقارنة طبقات التدرجات Percoll تتألف من 55٪، 65٪ و 75٪ المجلد / المجلد في برنامج تلفزيوني ، مما يؤدي في كثير من الأحيان في اختلاط واجهات Percoll، نظرا للاختلافات الكثافة صغيرة بين الطبقات الثلاث. وفيما يتعلق نهج اختيار immunomagnetic سلبية، كما تم الإبلاغ عنها لتكون موثوقة لعزل أعداد كبيرة من العدلات المختصة وظيفيا مع نقاء عالية وقدرتها على البقاء من نخاع العظام من الفئران 11
العدلات المعزولة باستخدام التدرج الكثافة طريقة الطرد المركزي صفها يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من المصب دراسات وظيفية خارج الحي مثل البلعمة والقتل والكيميائي، إنتاج السيتوكينات، انفجر التأكسدي والمقايسات تحبب باستخدام بروتوكولات نشرت 6. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون العدلات معزولةنقل adoptively في الفئران المصابة المتلقية لتقييم دور نقل العدلات على بقاء الماوس وآثار العدلات نقل على إرتباطات المناعية مثل إنتاج السيتوكينات في مواقع الإصابة في الفئران المتلقية. وتحقيقا لهذه الغاية، Tosello Boari وزملاؤه نقل adoptively العظام العدلات نخاع المستمدة في الفئران المتلقية Trypasonoma المصابة، التي أسفل التنظيم الإنترفيرون γ الإنتاج في الطحال والكبد المصابة وأدى إلى تحسين البقاء على قيد الحياة بطريقة IL-10 تعتمد 19.
وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تسمية العدلات مع CellTracker الأصباغ CMFDA وCMTMR دون نقصان واضح الصبغة التي يسببها في بقاء الخلية يوفر فرصة لتسمية تفاضلي العدلات من الفئران من مختلف الخلفيات الوراثية وتتبع الخلايا المسمى نقل adoptively في مختلف الأجهزة المستهدفة الماوس باستخدام التدفق الخلوي أو intravital المجهري. يتم الاحتفاظ الأصباغ CellTracker في viablالعدلات الإلكترونية ولا تنتشر إلى الخلايا المجاورة. في دراساتنا نستخدم تركيز من 5 ميكرومتر لوضع العلامات الخلية ونحن قادرون على تتبع بنجاح العدلات صفت في الدم ونخاع العظام والكلى من الفئران المتلقية المبيضات المصابة لمدة 4 ساعة على الأقل بعد نقل العدلة 6. وإلى جانب الأخضر CellTracker وCellTracker أورانج، والأصباغ الأخرى بما في ذلك البنفسج CellTracker، CFSE وسنارف-1 وقد استخدمت أيضا بنجاح لتسمية العظام الماوس العدلات نخاع المستمدة من التجارب لنقل بالتبني 11،19،20. وبالإضافة إلى ذلك، والأخضر CellTracker وCellTracker الأصباغ أورانج تم استخدامها بشكل فعال في تركزا مماثلا من 5 ميكرومتر لوصفها الخلايا T الطحال الماوس لنقل بالتبني وتتبع تجارب 21. القدرة على تسمية تفاضلي العدلات مع مختلف الأصباغ CellTracker يسمح لتصميم التجارب إعادة تعمير التنافسية التي نسبة 1:1 من العدلات المسمى تفاضلي من الفئران مع مختلفخلفيات وراثية يمكن نقلها adoptively في الفئران المتلقية، وذلك بهدف تحديد الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الأنسجة الملتهبة. نحن ذكرت مؤخرا أن chemokine مستقبلات Ccr1 يتوسط الاتجار العدلات من الدم إلى الكلى المبيضات المصابين في مراحل متأخرة من الإصابة، مما يؤدي إلى التراكم المفرط للالعدلات في الكلى، إصابات الأنسجة وانخفاض البقاء على قيد الحياة 6.
كما هو الحال مع أي بروتوكول، لديه طريقة لدينا أيضا القيود. على سبيل المثال، على الرغم من المزايا المذكورة آنفا من حصاد العدلات من نخاع العظم أكثر من الدم، وهناك اختلافات ملحوظة بين العدلات تم الحصول عليها من هذين القسمين، والتي تبعا لتطبيق البحوث المصب من الخلايا تحصد يمكن أن يكون لها تأثير على النتائج التجريبية. على وجه التحديد، العدلات الدم هي خلايا ناضجة، في حين العدلات من سلبيات نخاع العظمIST من ثلاث مجموعات سكانية فرعية مختلفة التي تتراوح من promyelocytes غير ناضج / myelocytes إلى metamyelocytes أقل غير ناضج / أشكال الفرقة إلى العدلات الناضجة، كما هو موضح سابقا 22. وبالتالي، يمكن للاختلاف في النضج بين خلية نخاع العظم والدم العدلات يؤدي إلى اختلاف في بعض الخصائص الوظيفية الخلية كما ذكرت في السابق انها لاستجابات العدلات إلى fMLF (N-formylmethionyl-لوسيل-فينيل ألانين) وابتلاع جسيمات 23. وعلاوة على ذلك، لأن أي تلاعب العدلة فيفو السابقين يمكن أن يؤدي إلى تنشيط الخلايا وموت الخلايا المبرمج، والحذر ضروري عند التعامل مع الخلايا خلال الطرد المركزي التدرج. وبالإضافة إلى ذلك، لأن الأصباغ CellTracker بتركيزات أكبر من 5 ميكرومتر يمكن أن تؤثر سلبا على البقاء على قيد الحياة العدلة، ينبغي اختبار هذا الاحتمال في التجارب الرائدة من قبل المحققين الفردية، اعتمادا على فحص وظيفي المصب التي سيتم اختبارها.
باختصار، نحن مسبقاأرسلت طريقة موثوقة وقابلة للتكرار التي يمكن استخدامها من قبل أي مختبر لجمع وتسمية أعداد كبيرة من العدلات الماوس من نخاع العظام. هذا النهج يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات الفنية العدلة بما في ذلك نقل بالتبني الجسم الحي والتجارب تتبع من قبل التدفق الخلوي وintravital المجهري. ينبغي استخدام هذا وبروتوكولات أخرى موثوق بها للماوس العدلة تنقية، والعزلة، ووضع العلامات ونقل بالتبني المصب والدراسات تتبع تعميق فهمنا للعلم وظائف الأعضاء العدلات على المستوى الجزيئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل شعبة بحوث جماعية من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID)، المعهد الوطني للصحة (NIH)، الولايات المتحدة الأمريكية.
تم الحفاظ على جميع الفئران في رابطة الأمريكية لاعتماد المختبرات العناية المعتمدة مرفق الحيوان الحيوان في المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) ويضم وفقا للإجراءات المبينة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية تحت رعاية بروتوكول التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام من المعدية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
