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Immunology and Infection

अलगाव, शोधन और कार्यात्मक अध्ययन और दत्तक स्थानांतरण प्रयोगों के लिए माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल का लेबल

Published: July 10, 2013 doi: 10.3791/50586
Automatic Translation
1, 1
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

Summary

हम घनत्व ढाल centrifugation द्वारा और CellTracker रंगों का उपयोग न्युट्रोफिल लेबलिंग के लिए माउस अस्थि मज्जा से neutrophils के अलगाव और शुद्धीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. यह नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन या दत्तक हस्तांतरण और ट्रैकिंग प्रयोगों के लिए neutrophils की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए एक सरल, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और किफायती तरीका का प्रतिनिधित्व करता है.

Abstract

न्यूट्रोफिल सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की आलोचना effector कोशिकाओं हैं. वे तेजी से तीव्र सूजन की साइटों में भर्ती और भड़काऊ परिवेश के आधार पर सुरक्षात्मक या रोगजनक प्रभाव डालती रहे हैं. बहरहाल, विभिन्न संक्रामक रोगों और भड़काऊ शर्तों में जीवाणुओं 'प्रेरक और immunopathogenic प्रभाव मध्यस्थता कि आणविक कारकों की प्रतिरक्षा, विस्तृत समझ में neutrophils की अनिवार्य भूमिका के बावजूद अभी भी आंशिक रूप क्योंकि उनके कम आधा जीवन, इनमें से निपटने के साथ कठिनाइयों की कमी है, कोशिकाओं और नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन और दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए neutrophils की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए विश्वसनीय प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की कमी है. इसलिए, सरल, तेजी से किफायती और विश्वसनीय तरीकों ऐसे phagocytosis, हत्या, cytokine उत्पादन, degranulation और तस्करी के रूप में कार्य का आकलन करने के लिए माउस neutrophils की पर्याप्त संख्या कटाई के लिए अति आवश्यक हैं. कि अंत करने के लिए,हम उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता के साथ चूहों की अस्थि मज्जा से जीवाणुओं की बड़ी संख्या को अलग करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में रूपांतरित किया जा सकता है जो एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घनत्व ढाल centrifugation आधारित प्रोटोकॉल, उपस्थित थे. इसके अलावा, हम फिर adoptively प्रवाह cytometry का उपयोग कम से कम 4 घंटे के बाद हस्तांतरण के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित कर दिया और कई ऊतकों में लगाया जा सकता है जो अलग neutrophils, लेबल करने CellTracker रंगों का उपयोग करता है कि एक साधारण प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, विभिन्न CellTracker रंगों के साथ जंगली प्रकार और जीन की कमी चूहों से neutrophils के अंतर लेबलिंग सफलतापूर्वक vivo में लक्ष्य ऊतकों में रक्त से neutrophils की तस्करी में विशिष्ट जीन की प्रत्यक्ष भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिस्पर्धी repopulation अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है .

Introduction

न्यूट्रोफिल मनुष्यों में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं. वे सूक्ष्मजीवों पर हमले के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली और अधिनियम के मुख्य सेलुलर घटक हैं. न्युट्रोफिल संख्या और / या कार्य प्रभावित है कि अधिग्रहीत neutropenia और प्राथमिक immunodeficiencies साथ मरीजों मेजबान बचाव 1 में इन कोशिकाओं के महत्व पर प्रकाश डालते हुए जीवन के लिए खतरा आक्रामक बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण, विकास. सूजन के ऊतकों 2 में खून से भर्ती neutrophils के सक्षम chemotactic ढाल उत्पन्न कि chemoattractants का स्राव होता है, जो एक करवाया सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, के शामिल होने में उनके आत्मीय पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स परिणामों से संक्रमण स्थल पर रोगजनकों पर हमले की प्रतिरक्षा मान्यता . जीवाणुओं के संक्रमण स्थल में प्रवेश करने के बाद, वे सक्रिय हो जाते हैं, जो साइटोकाइन और केमोकाइन उत्पादन, रोगज़नक़ तेज की ओर जाता है, और oxidative और गैर oxidative मुझे के माध्यम से हत्याchanisms 3. सहज प्रतिरक्षा में उनकी अच्छी तरह से पहचाना भूमिका के अलावा, जीवाणुओं को भी हाल ही में प्रभावी अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4 के initiators के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है. 5-7 संक्रामक और autoimmune रोगों की एक किस्म के रूप में दिखाया दूसरी ओर, अलग प्रतिरक्षा में उनकी सुरक्षा भूमिकाओं से, जीवाणुओं भी, अत्यधिक संचय और / या सूजन की साइटों पर सक्रियण के कारण ऊतक चोट और इम्युनोपैथोलोजी मध्यस्थता कर सकते हैं.

बढ़ते प्रभावी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और कई संक्रामक रोगों और भड़काऊ शर्तों, विश्वसनीय प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के इन कोशिकाओं और कमी से निपटने के साथ तकनीकी कठिनाइयों में उनके pleiotropic प्रेरक कार्यों में neutrophils की अनिवार्य भूमिका के बावजूद पिछले दशकों में जीवाणुओं के साथ अनुसंधान रुकावट है. इसलिए, neutrophils के अलगाव के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays के उपयोग न्युट्रोफिल की मध्यस्थता immunolo पर और अधिक अनुसंधान की सुविधा चाहिएgical कार्यों पूर्व vivo और इन विवो में. तिथि करने के लिए, कई तरीकों जैसे मानव रक्त का घनत्व ढाल centrifugation और माउस रक्त या अस्थि मज्जा 8,9, माउस रक्त या अस्थि मज्जा 10,11 से neutrophils की सकारात्मक या नकारात्मक immunomagnetic संवर्धन के रूप में neutrophils के अलगाव के लिए वर्णित है, और कटाई की गई है thioglycollate या अन्य भड़काऊ एजेंट 12 की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद चूहों की peritoneal गुहा से neutrophils की. जीवाणुओं आसानी से मानव रक्त से बड़ी संख्या में अलग किया जा सकता है, इस विधि कार्यात्मक अध्ययन या दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों 13 के लिए पर्याप्त neutrophils के अलगाव precludes कि माउस रक्त की सीमित मात्रा के कारण चूहों में suboptimal है. की उपज thioglycollate-हासिल हालांकि इसके अलावा, peritoneal गुहा से कोशिकाओं माउस खून की तुलना में अधिक है, भड़काऊ पेरिटोनियल पानी से धोना में neutrophils की पवित्रता के बीच होती है60-90%, और अलग neutrophils के एक सक्रिय फेनोटाइप दिखा रहे हैं. इस प्रकार, कोशिकाओं माउस peritoneal गुहा स्थिर राज्य के 12 में कुछ जीवाणुओं के रूप में इस विधि केवल सक्रिय के कार्यात्मक अध्ययन के प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन नहीं unstimulated neutrophils की जा सकता है का उपयोग कर एकत्र की. इसके बजाय, अस्थि मज्जा तो ऐसे phagocytosis, हत्या और degranulation, या प्राप्तकर्ता चूहों में दत्तक हस्तांतरण के रूप में नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो या तो unstimulated या सक्रिय neutrophils, 11,14, के बड़ी संख्या में कटाई के लिए एक सुविधाजनक जलाशय है.

इस के साथ साथ हम एक उच्च उपज प्रदान करता है जो एक सरल और तेजी से (~ 2 घंटा) प्रोटोकॉल का वर्णन (~ 6-12 × 10 6 जीवाणुओं / असंक्रमित माउस, या ऊपर 30-40 तक × 10 6 जीवाणुओं / संक्रमित माउस) शुद्ध (80 से -95%) अस्थि मज्जा से> 95% व्यवहार्यता के साथ जीवाणुओं. इस विधि घनत्व ढाल सेल अलगाववादी हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Histopaque, का उपयोग करता हैFicoll और सोडियम diatrizoate से मिलकर राशन मीडिया, चूहों की अस्थि मज्जा से जीवाणुओं को अलग करने के लिए. इस विधि रक्त या peritoneal गुहा की तुलना में माउस प्रति neutrophils की काफी बड़ी संख्या में पैदावार, यह स्थिर अवस्था में या संक्रमण के बाद दोनों चूहों से जीवाणुओं को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह टूटनेवाला का उपयोग करता है कि घनत्व ढाल centrifugation विधि की तुलना में परत करने के लिए आसान है किया जा सकता है 55% / 65% / पीबीएस 9 में 75% Percoll से मिलकर Percoll ढ़ाल. इसके अलावा, समय और शुद्ध जीवाणुओं को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक संसाधनों की काफी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी का उपयोग कर न्युट्रोफिल अलगाव की तुलना में कम कर रहे हैं. इसके अलावा, इस पद्धति का एक immunomagnetic संवर्धन कदम को शामिल नहीं करता है, क्योंकि यह अधिक लागत प्रभावी है, और यह इस प्रकार न्युट्रोफिल सक्रियण की संभावना कम है, चुंबकीय स्तंभ और एंटीबॉडी के लिए कोशिकाओं के जोखिम से बचा जाता है.

पृथक neutroph के कार्यात्मक अध्ययन के प्रदर्शन के अलावाआइएलएस पूर्व vivo और प्राप्तकर्ता चूहों में कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण, इस प्रोटोकॉल भी अलग CellTracker रंगों का उपयोग पृथक neutrophils की लेबलिंग के लिए एक विधि का वर्णन करता है. विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों से neutrophils के अंतर लेबलिंग खून से neutrophils की तस्करी में विशिष्ट जीन की प्रत्यक्ष भूमिका पर यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जो प्रवाह cytometry, का उपयोग कर प्राप्तकर्ता चूहों के ऊतकों में स्थानांतरित कर जीवाणुओं पर नज़र रखने के लिए प्रतिस्पर्धी repopulation पढ़ाई में रूपांतरित किया जा सकता है लक्ष्य सूजन अंगों 6 में.

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Protocol

1. माउस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के अलगाव

  1. संस्था के जानवरों की देखभाल समिति को मंजूरी दी प्रोटोकॉल का प्रयोग चूहों euthanize और 70% इथेनॉल के साथ पशु सतह स्प्रे.
  2. मध्य पेट में त्वचा का एक चीरा और कम extremities को कवर त्वचा सहित माउस के बाहर का भाग से त्वचा को हटा दें.
  3. कैंची का उपयोग कम extremities से मांसपेशियों कट और फीमर सिर तोड़ने से परहेज करते हुए सावधानी से, संयुक्त कूल्हे से ऐसीटैबुलम हटाना.
  4. एक छुरी और कैंची का उपयोग फीमर और टिबिया से शेष मांसपेशियों निकालें और हड्डी समाप्त होता नहीं तोड़ लिए संयुक्त घुटने व्यायाम देखभाल पर टिबिया से फीमर अलग. 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ठंडा 1640 RPMI 1X युक्त एक पेट्री डिश में हड्डियों रखें.
  5. एक टिशू कल्चर हुड के अंतर्गत निम्नलिखित कदम के लिए आगे बढ़ें. Neutrophi से बचने के लिए सख्त बाँझ तकनीक बनाए रखने के लिए अतिरिक्त एहतियात ले लोएल सक्रियण.
  6. हड्डियों की सतह से इथेनॉल कुल्ला करने के लिए ठंडा बाँझ पीबीएस में तीन बाद धोने (पेट्री डिश के भीतर) के बाद 70% इथेनॉल (एक पेट्री डिश के भीतर) के साथ प्रत्येक हड्डी कुल्ला.
  7. एक साफ बाँझ पेट्री डिश के अंदर, हड्डियों की epiphyses काट और उन्हें अलग रखना.
  8. एक 25 गेज सुई और RPMI 10% FBS और 2 मिमी EDTA के साथ पूरक से भरा एक 12 सीसी सिरिंज का उपयोग करें, और एक 100 माइक्रोन के साथ लगे एक 50 मिलीलीटर पेंच शीर्ष फाल्कन ट्यूब पर हड्डी शाफ्ट के दोनों सिरों से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं फ्लश फिल्टर. कुशलता से सभी कोशिकाओं को दूर करने के लिए, 25 गेज सुई का उपयोग हड्डियों की भीतरी सतह परिमार्जन.

नोट: हड्डियों की blanching कोशिकाओं को पर्याप्त scraped किया गया है कि इंगित करता है.

नोट: एक फीमर / टिबिया जोड़ी फ्लश करने के लिए मीडिया की लगभग 10 मिलीलीटर का उपयोग करें. मध्यम करने ईडीटीए जोड़ना कोशिकाओं के रोकने के लिए आवश्यक है.

  1. हड्डी epiphyses कटएक छुरी और एक 2.5 मिलीलीटर Eppendorf Combitip प्लस Biopur पिपेट टिप के पीछे के अंत का उपयोग कर 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उन्हें तोड़ के साथ छोटे 0.5-1 मिमी 3 टुकड़ों में.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 7 मिनट के लिए 1400 rpm पर अपकेंद्रित्र
  3. लगभग 20 सेकंड के लिए NaCl 0.2% की 20 मिलीलीटर में सेल गोली resuspending द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं lyse 1.6% NaCl के 20 मिलीलीटर के अलावा द्वारा पीछा किया. (महत्वपूर्ण: अस्थि मज्जा कोशिका मृत्यु से बचने के लिए hypotonic सेल की 20-30 सेकंड से अधिक मत बाद के जीवाणुओं को सक्रिय करने की क्षमता है क्योंकि सेल के लिए hypotonic NaCl के उपयोग एसीके lysing बफर से अधिक की सिफारिश की है.).
  4. 4 में 1,400 rpm पर 7 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए.
  5. 10% FBS और 2 मिमी EDTA के साथ पूरक 1640 RPMI 1X के साथ कोशिकाओं को धो लें और कदम 1.12 में के रूप में अपकेंद्रित्र.
  6. इस पद्धति का उपयोग अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की उपज लगभग 60-80000000 असंक्रमित 8-12 सप्ताह पुराने C57BL 6 / माउस प्रति है.

2. न्यूट्रोफिल की जुदाईघनत्व ढाल centrifugation द्वारा

  1. अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गणना और बर्फ ठंड बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में resuspend.
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में Histopaque 1119 के 3 मिलीलीटर (घनत्व 1.119 ग्राम / एमएल) जोड़ें.
  3. Histopaque 1119 के 3 मिलीलीटर पर Histopaque 1077 के ओवरले 3 मिलीग्राम (घनत्व 1.077 ग्राम / एमएल).

नोट: Histopaque 1119 और Histopaque 1077 18-26 तक गरम किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस उपयोग करने से पहले.

महत्वपूर्ण कदम: तुरंत अग्रिम में ढाल दो परतों और suboptimal न्युट्रोफिल पवित्रता और वसूली के बीच प्रसार में परिणाम होगा की तैयारी के रूप में उपयोग करने से पहले ढ़ाल तैयार.

महत्वपूर्ण कदम: overlaying centrifugation के दौरान सेल जुदाई रोकना होगा जो दो घनत्व, मिश्रण से बचने के क्रम में धीरे धीरे किया जाना 1119 की जरूरत पर Histopaque 1077.

  1. Histopaque 1077 के शीर्ष पर अस्थि मज्जा सेल निलंबन ढ़कें.

महत्वपूर्ण कदम: Overlकोशिकाओं और 1077 Histopaque के बीच इंटरफेस परेशान करने से बचने के क्रम में धीरे धीरे किया जाना Histopaque 1077 आवश्यकताओं से अधिक अस्थि मज्जा सेल निलंबन Aying.

नोट: पीबीएस के 1 मिलीलीटर में एक असंक्रमित माउस से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं resuspending> 90% की न्युट्रोफिल पवित्रता पैदावार. हालांकि, कई अस्थि मज्जा के नमूनों पूलिंग न्युट्रोफिल शुद्धता समझौता, उदाहरण के लिए, 3 मिलीलीटर पीबीएस ~ 80% करने के लिए> 90% से न्युट्रोफिल पवित्रता को कम कर देता में 300 x 10 6 कोशिकाओं resuspending. इसलिए, जांचकर्ताओं को उनकी विशिष्ट प्रयोगों के लिए आदर्श कोशिकाओं की संख्या / मात्रा की स्थिति की पहचान करने के लिए पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करना चाहिए

  1. 25 से कम 2,000 rpm पर 30 मिनट डिग्री ब्रेक के बिना सी के लिए अपकेंद्रित्र.

नोट: कमरे के तापमान पर ढाल की केन्द्रापसारण neutrophils के प्रभावी जुदाई के लिए महत्वपूर्ण और आवश्यक है.

  1. Histopaque 1119 के इंटरफेस में जीवाणुओं लीजिए और 1077 परतों Histopaque. RPMI के साथ दो बार एकत्र जीवाणुओं धो 1640 1X 10% FBS और 4 में 7 मिनट के लिए 1400 rpm पर 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक
  2. जीवाणुओं की गणना और उनकी व्यवहार्यता का निर्धारण.

नोट: न्यूट्रोफिल आम तौर पर कर रहे हैं> FACS विश्लेषण द्वारा निर्धारित 95% व्यवहार्य और> 90% शुद्ध. एक असंक्रमित 8-12 सप्ताह पुराने C57BL 6 / माउस की अस्थि मज्जा से neutrophils की ठेठ उपज (यानी 2 फीमर और 2 टिबिया हड्डियों) ~ 6-12000000 कोशिकाओं है. जीवाणुओं से संक्रमित जानवरों के अस्थि मज्जा से काटा जाता है जब यह संख्या काफी अधिक है. Candida के संक्रमित चूहों सेल कटाई 6 के लिए इस्तेमाल किया गया जब इसलिए, ~ 30-40000000 जीवाणुओं / माउस बरामद किए गए.

3. CellTracker रंगों का प्रयोग न्यूट्रोफिल की लेबलिंग

  1. 5 में जीवाणुओं Resuspend x 10 6 कोशिकाओं / पीबीएस में मिलीलीटर 37 prewarmed डिग्री सेल्सियस
  2. एक अंतिम concent में एक CellTracker डाई जोड़ें5 माइक्रोन का राशन.

नोट: CellTracker ग्रीन (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetate) और CellTracker ऑरेंज (CMTMR (5 - (और -6)-4-Chloromethyl Benzoyl एमिनो Tetramethylrhodamine) विभिन्न प्रकार के जंगली और जीन की कमी से जीवाणुओं लेबल करने के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था चूहों.

नोट: प्रयोग के दिन तक -80 में 10 CellTracker ग्रीन की मिमी और CellTracker ऑरेंज, विभाज्य, और दुकान के एक शेयर समाधान डिग्री सेल्सियस की तैयारी.

  1. अंधेरे में एक मिलाते हुए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इसी CellTracker डाई के 5 माइक्रोन से जीवाणुओं को सेते हैं.
  2. 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ठंडा 1640 RPMI 1X के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं.

नोट: कोशिकाओं के कुशल धोने CellTracker डाई के साथ लेबलिंग कदम चढ़ाव के लिए विभिन्न लेबल न्युट्रोफिल आबादी के मिश्रण से पहले डाई पार संक्रमण से बचने के लिए आवश्यक है के बादtream प्रतिस्पर्धी repopulation पढ़ाई.

4. चूहे और फ्लो का प्रयोग तबादला न्यूट्रोफिल के विश्लेषण में न्यूट्रोफिल की दत्तक स्थानांतरण

  1. 25 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल और 5 एक्स 10 6 जीवाणुओं माउस प्रति स्थानांतरित कर रहे हैं कि इतने पार्श्व पूंछ नस में निलंबन के 200 μl इंजेक्षन की एकाग्रता में ठंडा पीबीएस में Resuspend जीवाणुओं. प्रतियोगी repopulation न्युट्रोफिल पढ़ाई के लिए, एक 1:1 के अनुपात में जंगली प्रकार और जीन की कमी जीवाणुओं का मिश्रण है और ऊपर के रूप में माउस प्रति 5 एक्स 10 6 जीवाणुओं की कुल इंजेक्षन.

नोट: कम से कम करने के लिए 10 एक्स 10 6 जीवाणुओं adoptively जानवरों को स्पष्ट तत्काल विषाक्तता के बिना माउस प्रति हस्तांतरित किया जा सकता है.

  1. दत्तक हस्तांतरण (जैसे 1, 2, 3 या 4 घंटे के बाद हस्तांतरण) के बाद अलग अलग समय पर, चूहों और फसल रक्त euthanize, और / या ब्याज की अस्थि मज्जा और / या अन्य लक्ष्य अंग (एस).
  2. सी तैयारप्रकाशित प्रोटोकॉल 6,15 का उपयोग कर adoptively हस्तांतरित लेबल neutrophils की मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए इन ऊतकों से ngle सेल निलंबन.
  3. मृत / रहते व्यवहार्यता धुंधला और एफसी नाकाबंदी, CD45 (क्लोन 30-F11) के साथ लेबल कोशिकाओं, Ly6G (क्लोन 1A8) और CD11b (क्लोन M1/70) और गेट रहते CD45 + Ly6G + CD11b + जीवाणुओं पर. के बाद इस गेट में neutrophils FITC (+ CellTracker ग्रीन के साथ लेबल है) या पीई + (सेल ट्रैकर ऑरेंज के साथ लेबल अगर) हैं जो प्राप्तकर्ता माउस का देशी जीवाणुओं के साथ ही adoptively हस्तांतरित लेबल neutrophils, शामिल हैं.

नोट: न्यूट्रोफिल कम से कम 4 घंटे के बाद हस्तांतरण के लिए Candida के संक्रमित चूहों के रक्त, अस्थि मज्जा और गुर्दे में लगाया जा सकता है.

नोट: पीबीएस में 2% paraformaldehyde के साथ फिक्सेशन प्रतिकूल CellTracker जीआर के साथ लेबल neutrophils के मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रभावित नहीं करताकम से कम 48 घंटे के लिए een है या CellTracker ऑरेंज.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल चूहों से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Histopaque सेल जुदाई मीडिया का उपयोग घनत्व ढाल centrifugation द्वारा इन कोशिकाओं से neutrophils के बाद जुदाई की फसल के लिए अनुकूलित है. न्यूट्रोफिल इस विधि का उपयोग कर नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन पूर्व vivo की एक किस्म के लिए और प्राप्तकर्ता चूहों में दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अलग.

असंक्रमित 8-12 सप्ताह पुराने C57BL 6 / माउस प्रति femurs और टिबिया दोनों से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के संग्रह की खासियत उपज ~ 94-98% की व्यवहार्यता के साथ ~ 60-80000000 कोशिकाओं है. इन कोशिकाओं के बहाव के घनत्व ढाल centrifugation Histopaque घनत्व जुदाई मीडिया का इस्तेमाल आम तौर पर असंक्रमित माउस ~ प्रति 6-12000000 जीवाणुओं पैदावार. न्यूट्रोफिल 80-95% शुद्ध कर रहे हैं और> 95% व्यवहार्य, के रूप में प्रवाह cytometry (चित्रा 1) के द्वारा सत्यापित. यह घनत्व से पहले कई जानवरों से पूल अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के लिए संभव हैढाल centrifugation कदम, पूलिंग कोशिकाओं से थोड़ा अलग neutrophils की शुद्धता कम हो जाती है. पीबीएस पैदावार 1-3 मिलीलीटर में एक असंक्रमित माउस से 60-80000000 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं overlaying जबकि> 90% शुद्ध neutrophils, उदाहरण के लिए, सेल पवित्रता ~ 300 मिलियन अस्थि मज्जा की कोशिकाओं 3 में एक साथ जमा कर रहे हैं जब तक ~ 80% तक कम हो जाती है पीबीएस और मढ़ा के मिलीलीटर.

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का भी प्रवाह cytometry का उपयोग प्राप्तकर्ता चूहों में adoptively हस्तांतरित कोशिकाओं की नज़र रखने के लिए अनुमति देता है जो CellTracker रंगों, साथ neutrophils के बाद लेबलिंग के लिए कदम का वर्णन करता है. लेबल neutrophils रहने के रूप में CMFDA या CMTMR के 5 माइक्रोन से neutrophils की लेबलिंग न्युट्रोफिल अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है> 95% व्यवहार्य (डेटा) नहीं दिखाया. लेबल neutrophils रहते CD45 पर gating के द्वारा प्रवाह cytometry का उपयोग दत्तक हस्तांतरण के बाद कम से कम 4 घंटे के लिए विभिन्न माउस ऊतकों में पता लगाया जा सकता है + Ly6G + CD11b + कोशिकाओं (चित्रा 2).प्रतियोगी repopulation पढ़ाई में जंगली प्रकार की तुलना में जीन की कमी neutrophils में अंतर लेबलिंग रंगों के उपयोग से किसी दिए गए लक्ष्य अंग में खून से neutrophils की तस्करी में एक विशेष जीन (जैसे chemoattractant रिसेप्टर 6) की प्रत्यक्ष भूमिका के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. घनत्व ढाल centrifugation प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए एक असंक्रमित C57BL 6 / माउस की अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से अलग neutrophils के प्रतिनिधि FACS साजिश. बाएं पैनल आगे का उपयोग करते हुए और Histopaque 1119 और Histopaque 1077 के इंटरफ़ेस से एकत्र अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल प्रारंभिक gating को दर्शाता है ओर तितर बितर (FSC / एसएससी). दिखाया गया है, इंटरफ़ेस से एकत्र जीवाणुओं> 90% शुद्ध (मध्यम पैनल) और> 95% व्यवहार्य (सही पैनल) हैं.

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चित्रा 2. के प्रतिनिधि FACS साजिश adoptively हस्तांतरित CMTMR लेबल रक्त, अस्थि मज्जा और एक प्राप्तकर्ता Candida के संक्रमित C57BL 6 / माउस 4 घंटा निम्नलिखित सेल हस्तांतरण के गुर्दे से काटा जीवाणुओं. Adoptively हस्तांतरित CMTMR लेबल neutrophils पीई पॉजिटिव हैं और से भेदभाव किया जा सकता है पीई नकारात्मक हैं जो प्राप्तकर्ता माउस का देशी neutrophils,. CD11b की अभिव्यक्ति रक्त और अस्थि मज्जा से काटा जीवाणुओं की तुलना में गुर्दे से काटा neutrophils में अधिक से अधिक है कि ध्यान दें. गुर्दे neutrophils में CD11b अभिव्यक्ति में वृद्धि के परिणाम पिछले 15 के अनुरूप है और संभावना प्रणालीगत कैंडिडिआसिस के माउस मॉडल में मुख्य लक्ष्य अंग है जो गुर्दे, में प्रवेश पर कोशिकाओं की सक्रियता को दर्शाता है.

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Discussion

इस के साथ साथ हम एक घनत्व ढाल centrifugation दृष्टिकोण का उपयोग उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता के साथ चूहों की अस्थि मज्जा से जीवाणुओं की बड़ी संख्या के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय, सरल, तेज और किफायती प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है, ~ 6-12 × 10 6 जीवाणुओं एक असंक्रमित माउस से बरामद किया जा सकता है और के रूप में कई ~ के रूप में 30-40 × 10 6 जीवाणुओं के संक्रमण 6 के बाद एक माउस से अलग किया जा सकता है. पृथक जीवाणुओं 80-95% शुद्ध और> 95% व्यवहार्य हैं.

अस्थि मज्जा बहाव कार्यात्मक अध्ययन और दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए माउस जीवाणुओं प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त जलाशय है. सबसे पहले, यह पहले से दोनों डिब्बों से कोशिकाओं समान ऑक्सीडेटिव फट और degranulation 16 प्रदर्शन के रूप में अस्थि मज्जा जीवाणुओं चूहों में रक्त जीवाणुओं का कार्यात्मक समान हैं कि दिखाया गया है. दूसरा, माउस अस्थि मज्जा जीवाणुओं protr जीवित करने के लिए दिखाया गया हैसंस्कृति में समय से काम किया अवधि, काफी लंबे समय तक माउस रक्त neutrophils के 16 की तुलना में. इसलिए, रक्त जीवाणुओं से अधिक अस्थि मज्जा की कटाई कार्यात्मक assays के पूर्व vivo के लिए संसाधित जब कोशिकाओं का अधिक से अधिक उपज के लिए अनुमति दे सकता है. अस्थि मज्जा से neutrophils की तीसरी, अलगाव स्थिर अवस्था में है और संक्रमण के बाद दोनों नीचे की ओर दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए पर्याप्त हैं जो जीवाणुओं की काफी बड़ी संख्या में उबरने का लाभ प्रदान करता है. इसके बजाय, काफी कम जीवाणुओं भी संक्रमण के बाद, माउस खून से बरामद किया है, और नहीं कई जीवाणुओं peritoneal गुहा में स्थिर राज्य में मौजूद हैं किया जा सकता है. इस प्रकार, thioglycollate या अन्य एजेंट आमतौर पर पेरिटोनियम में सक्रिय neutrophils की भर्ती को बढ़ावा देने के लिए उपयोग किया जाता है, इस पद्धति पेरिटोनियल तीव्र भड़काऊ पीब (अप्रकाशित, डेटा दिखाया गया है) और एक सक्रिय न्युट्रोफिल phenotyp की प्रेरण भीतर neutrophils के चर पवित्रता आड़े आती हैunmanipulated चूहों से बरामद unstimulated neutrophils के उस से अलग है जो ई,.

कई तरीकों से चूहों की अस्थि मज्जा से neutrophils के अलगाव के लिए उपलब्ध हैं. ये (एक) घनत्व ढाल centrifugation ऐसे Histopaque घनत्व जुदाई मीडिया का उपयोग करता है कि हम यहाँ मौजूद एक, और असंतत Percoll ढ़ाल 17 का उपयोग करता है कि एक समान पद्धति, (ख) अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को चिह्नित कर रहे हैं जिसके दौरान सकारात्मक immunomagnetic चयन दृष्टिकोण, साथ ही दृष्टिकोण शामिल ऐसे Ly6G, और neutrophils के रूप में एक न्युट्रोफिल विशिष्ट एंटीबॉडी तो (ग) अस्थि मज्जा की कोशिकाओं एंटीबॉडी के एक कॉकटेल के साथ चिह्नित कर रहे हैं जिसके दौरान नकारात्मक चयन immunomagnetic दृष्टिकोण, कि बाँध एक चुंबकीय स्तंभ 18 पर Ly6G पॉजिटिव कोशिकाओं के बंधन से समृद्ध कर रहे हैं (टी lymphocytes के लिए यानी CD5, बी लिम्फोसाइटों के लिए CD45R/B220, एन.के. कोशिकाओं के लिए CD49b/DX5, मस्तूल कोशिकाओं और hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के लिए CD117, F4/80 के लिए जीवाणुओं के अलावा अन्य कोशिकाओं परमैक्रोफेज और एरिथ्रोसाइट्स के लिए Ter119) 11, और तब जीवाणुओं चुंबकीय स्तंभ पर बाध्य नहीं करता कि कोशिकाओं की प्रतिरक्षी नकारात्मक अंश के रूप में क्षालन से समृद्ध, और (घ) प्रतिदीप्ति सेल छंटनी सक्रिय, जिसके दौरान अस्थि मज्जा की कोशिकाओं एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैं कर रहे हैं neutrophils और अन्य कोशिकाओं, और neutrophils पर कि बाँध तो ऐसे Ly6G और CD11b के संयोजन के रूप में न्युट्रोफिल मार्कर के लिए सकारात्मक रहे हैं कि कोशिकाओं के रूप में एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर का उपयोग कर अलग हो रहे हैं.

सकारात्मक immunomagnetic चयन दृष्टिकोण और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी दोनों बहुत उच्च पैदावार और माउस neutrophils की purities प्रदान हालांकि, इन तरीकों लेबलिंग एजेंट संभवतः अपने कार्य को बदल सकता है, जो जीवाणुओं की सतह पर बाँध कि हमारे प्रोटोकॉल की तुलना में नुकसान है. सकारात्मक immunomagnetic चयन दृष्टिकोण एंटीबॉडी लेबल जीवाणुओं के लिए एक चुंबकीय स्तंभ पर कि बाँध अतिरिक्त सीमायह भी सेल समारोह को प्रभावित कर सकता है, जो eparation,. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी काफी लंबे समय प्रतिकूल आधा जीवन उनके छोटे की वजह neutrophils के अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है जो एक प्रयोगशाला कोर सुविधा में एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर का उपयोग कोशिकाओं की वसूली के लिए आवश्यक है कि अतिरिक्त खामी है. हमारे विधि असंतत Percoll ढ़ाल का उपयोग करता है कि घनत्व ढाल centrifugation विधि के बराबर है, लेकिन लेयरिंग दो Histopaque घनत्व जुदाई मीडिया लेयरिंग 55%, 65% और 75% से मिलकर Percoll ढ़ाल की तुलना में तकनीकी रूप से काफी कम चुनौतीपूर्ण पीबीएस में / खंड खंड , जो अक्सर तीन परतों के बीच छोटे घनत्व मतभेद के कारण Percoll इंटरफेस की intermixing में परिणाम है. नकारात्मक immunomagnetic चयन दृष्टिकोण के संबंध में, वे भी चूहों 11 की अस्थि मज्जा से उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता के साथ कार्यात्मक सक्षम neutrophils की बड़ी संख्या के अलगाव के लिए विश्वसनीय होने के लिए सूचित किया गया है

वर्णित घनत्व ढाल centrifugation विधि का उपयोग कर पृथक जीवाणुओं ऐसे phagocytosis, हत्या, कीमोटैक्सिस, cytokine उत्पादन, ऑक्सीडेटिव फट और प्रकाशित प्रोटोकॉल 6 का उपयोग कर degranulation assays के रूप में नीचे की ओर कार्यात्मक अध्ययन पूर्व vivo की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, पृथक neutrophils, हो सकता हैadoptively न्युट्रोफिल माउस अस्तित्व पर हस्तांतरण और इस तरह के प्राप्तकर्ता चूहों में संक्रमण की साइटों पर cytokine उत्पादन के रूप में प्रतिरक्षा संबद्ध पर हस्तांतरित neutrophils के प्रभाव की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए प्राप्तकर्ता संक्रमित चूहों में स्थानांतरित कर दिया. कि अंत करने के लिए, Tosello Boari और उनके सहयोगियों adoptively Trypasonoma संक्रमित प्राप्तकर्ता चूहों, जो नीचे विनियमित IFN-γ संक्रमित प्लीहा और जिगर में उत्पादन और एक आईएल -10 निर्भर ढंग से 19 में सुधार अस्तित्व में हुई. में मज्जा व्युत्पन्न neutrophils, हड्डी का तबादला

इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता में स्पष्ट डाई प्रेरित कमी के बिना CellTracker रंगों CMFDA और CMTMR साथ जीवाणुओं लेबल करने की क्षमता विभिन्न विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों से जीवाणुओं लेबल और प्रवाह का उपयोग कर विभिन्न माउस लक्ष्य अंगों में adoptively हस्तांतरित लेबल की कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है cytometry या intravital माइक्रोस्कोपी. CellTracker रंगों viabl में बनी रहती हैंई neutrophils और आसन्न कोशिकाओं को फैलाना नहीं है. हमारे अध्ययन में हम सेल लेबलिंग के लिए 5 माइक्रोन की एकाग्रता का उपयोग करें और हम सफलतापूर्वक न्युट्रोफिल हस्तांतरण 6 के बाद कम से कम 4 घंटे के लिए रक्त, अस्थि मज्जा और Candida से संक्रमित प्राप्तकर्ता चूहों के गुर्दे में लेबल जीवाणुओं को ट्रैक करने में सक्षम हैं. CellTracker ग्रीन और CellTracker वायलेट, CFSE और snarf -1 सहित CellTracker ऑरेंज, अन्य रंगों के अलावा भी दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों 11,19,20 के लिए लेबल माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न जीवाणुओं का सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, CellTracker ग्रीन और CellTracker ऑरेंज रंगों प्रभावी रूप से दत्तक हस्तांतरण के लिए माउस प्लीहा टी कोशिकाओं लेबलिंग और प्रयोगों 21 पर नज़र रखने के लिए 5 माइक्रोन की एक ऐसी ही एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया है. विभिन्न विभिन्न CellTracker रंगों के साथ जीवाणुओं लेबल करने की क्षमता में जो चूहों से विभिन्न लेबल neutrophils की एक 1:1 अनुपात अलग से प्रतिस्पर्धी repopulation प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए अनुमति देता हैआनुवंशिक पृष्ठभूमि adoptively सूजन के ऊतकों में रक्त से neutrophils की तस्करी में विशिष्ट जीन की प्रत्यक्ष भूमिका निर्धारित करने के लिए एक उद्देश्य के साथ प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित किया जा सकता है. हमने हाल ही में Candida के संक्रमित गुर्दे में रक्त से neutrophils की केमोकाइन रिसेप्टर Ccr1 मध्यस्थता तस्करी संक्रमण के पाठ्यक्रम में देर हो गई, जो गुर्दे, ऊतक चोट में neutrophils के अत्यधिक संचय में परिणाम की रिपोर्ट है कि और अस्तित्व 6 कमी हुई.

किसी भी प्रोटोकॉल के साथ, हमारे विधि भी सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, रक्त से अधिक अस्थि मज्जा से जीवाणुओं कटाई के aforementioned लाभ के बावजूद, काटा कोशिकाओं के बहाव के अनुसंधान के आधार पर आवेदन प्रयोगात्मक परिणामों पर असर हो सकता है, जो इन दो डिब्बों से प्राप्त जीवाणुओं के बीच उल्लेखनीय मतभेद हैं. विशेष रूप से, रक्त neutrophils, अस्थि मज्जा विपक्ष से जीवाणुओं जबकि, परिपक्व कोशिकाओं रहे हैंअपरिपक्व promyelocytes / myelocytes से परिपक्व जीवाणुओं का कम अपरिपक्व metamyelocytes / बैंड रूपों के लिए सीमा, के रूप में पहले 22 में वर्णित है कि तीन अलग subpopulations की पहली. यह पहले से न्युट्रोफिल fMLF लिए प्रतिक्रियाओं (एन formylmethionyl-leucyl फेनिलएलनिन) और कणों 23 की घूस के लिए सूचित किया गया था के रूप में इसलिए, अस्थि मज्जा और रक्त जीवाणुओं के बीच सेल परिपक्वता में अंतर कुछ सेल कार्यात्मक विशेषताओं में भिन्नता हो सकती थी. किसी भी न्युट्रोफिल हेरफेर पूर्व vivo सेल सक्रियण और apoptosis में परिणाम सकता है क्योंकि ढाल centrifugation के दौरान कोशिकाओं से निपटने जब ​​इसके अलावा, सावधानी आवश्यक है. 5 माइक्रोन से अधिक सांद्रता में CellTracker रंगों प्रतिकूल न्युट्रोफिल अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि इसके अलावा, इस संभावना का परीक्षण किया जाएगा कि बहाव के कार्यात्मक परख के आधार पर, व्यक्तिगत जांचकर्ताओं द्वारा पायलट प्रयोगों में परीक्षण किया जाना चाहिए.

संक्षेप में, हम पूर्वअस्थि मज्जा से माउस neutrophils की बड़ी संख्या को इकट्ठा करने और लेबल करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला द्वारा नियोजित किया जा सकता है कि एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि भेजा. यह दृष्टिकोण प्रवाह cytometry और intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा विवो दत्तक हस्तांतरण और ट्रैकिंग प्रयोगों में शामिल न्युट्रोफिल कार्यात्मक अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस की और माउस न्युट्रोफिल शुद्धि, अलगाव, लेबलिंग और नीचे की ओर दत्तक हस्तांतरण और ट्रैकिंग पढ़ाई के लिए अन्य विश्वसनीय प्रोटोकॉल का उपयोग आणविक स्तर पर न्युट्रोफिल शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ को गहरा करना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा हितों है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस काम के एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच), संयुक्त राज्य अमेरिका के अंदर का रिसर्च डिवीजन के द्वारा समर्थित किया गया था.

सभी चूहों एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) में प्रयोगशाला पशु की देखभाल से मान्यता प्राप्त जानवरों की सुविधा के प्रत्यायन के लिए एक अमेरिकन एसोसिएशन में बनाए रखा है और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित प्रक्रियाओं के अनुसार रखे जाते थे NIAID के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तत्वावधान में.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES Cellgro 10-041-CV  
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) GemCell 100500  
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140  
0.5 M EDTA Quality Biological Inc 351-027-101  
0.2% and 1.6% sodium chloride JT Baker 3624 Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771 Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV  
Ethyl Alcohol (200 proof) The Warner Graham Company 64-17-5  
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) Invitrogen C-7025 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) Invitrogen C-2927 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) eBioscience 170451-82  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551461  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 560599  
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) eBioscience 47-0112-82  
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Pharmingen 553141 Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Molecular Probes L-23105 Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma 67-68-5  
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS USB Corporation 19943  
  Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
  Materials
C57BL/6 mice Taconic  
15 ml centrifuge tubes Corning 430053  
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070  
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B  
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B  
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B  
Pasteur pipettes (3 ml) BD Falcon 357575  
12 ml syringes Kendall monoject 512878  
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122  
100 mm cell strainers BD Falcon 352360  
Bactericidal Petri dishes BD Falcon 351029  
Combitips Plus Biopur Eppendorf 2249608-5  
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) Biomedical Research Instruments 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 Instruments sterilized prior to use
  Equipment
Tissue culture hood The Baker Company SG403  
Refrigerated centrifuge Thermo Fischer Scientific 75004521  
37 °C shaking water bath Thermo Fischer Scientific 3166721  
  Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.

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References

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Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J. Vis. Exp. (77), e50586, doi:10.3791/50586 (2013).

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