Summary
אנו מתארים פרוטוקול לבידוד וטיהור של נויטרופילים ממח עצם בעכבר על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ותיוג באמצעות צבעי CellTracker נויטרופילים. זה מייצג שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור וחסכוני להשגת מספר גדול של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם או ניסויי העברה ומעקב מאמצים.
Abstract
הנויטרופילים הם תאי מפעיל קריטיים של מערכת החיסון המולדת. הם גויסו במהירות באתרים של דלקת חריפה והשפעות המגנות או פתוגניים בהתאם לסביבה הדלקתית. יחד עם זאת, על אף התפקיד החיוני של נויטרופילים בחסינות, הבנה מפורטת של הגורמים המולקולריים המתווכים השפעות מפעיל וimmunopathogenic 'נויטרופילים במחלות זיהומיות שונות ומצבים דלקתיים עדיין חסר, גם בגלל זמן מחצית החיים הקצר שלהם, את הקשיים בטיפול באלה תאים והעדר פרוטוקולי ניסוי אמינים להשגת כמות מספקת של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם וניסויים העברת מאמצת. לכן, שיטות פשוטות, מהירות, חסכונית ואמינות הן רצויות מאוד לקציר בכמות מספקת של נויטרופילים עכבר להערכת פונקציות כגון phagocytosis, הרג, ציטוקינים ייצור, degranulation וסחר בנשים. לשם כך,אנו מציגים פרוטוקול לשעתק צפיפות שיפוע מבוסס צנטריפוגה, אשר יכולה להיות מותאם בכל מעבדה לבודד מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר וכדאיות גבוהים. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט שמשתמש בצבעי CellTracker לתייג את נויטרופילים הבודדים, אשר לאחר מכן ניתן להעביר adoptively לעכברים נמען ולעקוב אחריו בכמה רקמות להעברה לאחר לפחות 4 שעות באמצעות cytometry זרימה. שימוש בגישה זו, תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברי wild-type והגן לקויים עם צבעי CellTracker שונים יכול להיות מועסק בהצלחה לבצע מחקרי Repopulation תחרותיים להערכת התפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם אל רקמות יעד in vivo .
Introduction
הנויטרופילים הם לויקוציטים הנפוץ ביותר בבני אדם. הם המרכיב התאי העיקרי של מערכת החיסון המולדת ולפעול כקו הגנה ראשון נגד הפולשים מיקרואורגניזמים. חולים עם נויטרופניה רכשה וimmunodeficiencies העיקרי המשפיעים על מספרים ו / או פונקצית נויטרופילים לפתח זיהומים, המדגישים את החשיבות של תאים אלה בשורת 1 הגנת חיידקים ופטריות פולשניות מסכנות חיים. הכרה חיסונית של פלישת פתוגנים באתר הזיהום על ידי תוצאות זיהוי ההכרה הקולטנים מאותו המקור שלהם באינדוקציה של תגובה חיסונית מולדת מתוזמרת, מה שמוביל להפרשת chemoattractants שיוצרים שיפוע chemotactic מסוגלים נויטרופילים גיוס ממחזור הדם לתוך הרקמה הדלקתית 2 . לאחר נויטרופילים להיכנס לאתר הזיהום, הם הופכים להיות פעילים, מה שמוביל לציטוקינים וchemokine ייצור, ספיגת הפתוגן, והרג דרכי חמצוני והלא חמצוניchanisms 3. חוץ מזה התפקיד שלהם המוכר היטב בחסינות מולדת, נויטרופילים יש גם הוכחו לאחרונה לתפקיד חשוב כיוזמי תגובות חיסוניות אדפטיבית יעילות 4. מצד השני, מלבד התפקידים המגן שלהם בחסינות, נויטרופילים עשויים גם לתווך פגיעה ברקמות וimmunopathology בשל צבירה ו / או הפעלה באתרים של דלקת מוגזמת, כפי שמוצגים במגוון רחב של מחלות זיהומיות ומחלות אוטואימוניות 5-7.
למרות התפקיד החיוני של נויטרופילים בתגובות חיסוניות מולדות הרכבה יעילות ופונקציות מפעיל pleiotropic בכמה מחלות זיהומיות ומצבים דלקתיים, בעיות טכניות בטיפול בתאים אלה וחוסר פרוטוקולי ניסוי אמינים עכב מחקר עם נויטרופילים בעשורים האחרונים. לכן, שימוש במבחנים לשעתק לבידוד של נויטרופילים צריכים להקל על מחקר נוסף על immunolo נויטרופילים בתיווךvivo gical הפונקציות לשעבר וin vivo. נכון להיום, מספר שיטות שתוארו לבידוד של נויטרופילים כגון צנטריפוגה צפיפות שיפוע של דם אדם ודם עכבר או מח עצם 8,9, העשרת immunomagnetic חיובית או שלילית של נויטרופילים מדם עכבר או מח עצם 10,11, וקציר של נויטרופילים מחלל הצפק של עכברים לאחר הזרקת intraperitoneal של thioglycollate או סוכנים דלקתיים אחרים 12. למרות שיכולים להיות מבודד בקלות נויטרופילים במספרים גדולים מדם אנושי, שיטה זו היא הכי מוצלח בעכברים, בשל הכמות המוגבלת של דם עכבר שמונע בידוד של נויטרופילים מספיקים ללימודים תפקודיים או ניסויי העברת מאמצת 13. בנוסף, למרות שהתשואה של thioglycollate-הושרה התאים מחלל הצפק הוא גדולים יותר בהשוואה לזה של דם עכברים, טוהר של נויטרופילים בשטיפת הצפק הדלקתי משתנה בין60-90%, ונויטרופילים המבודדים תערוכת פנוטיפ הופעל. לכן, התאים שנאספו בשיטה זו ניתן להשתמש רק לביצוע מחקרים תפקודיים של הופעל אך לא של נויטרופילים unstimulated, כחלל הצפק העכבר יש כמה נויטרופילים במצב היציב 12. במקום זאת, מח העצם הוא מאגר נוח לקצירת מספרים גדולים של שני unstimulated או הופעלו נויטרופילים 11,14, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בם ללימודי המשך, פונקציונליים, כגון phagocytosis, הרג וdegranulation, או להעברת מאמצת לעכברים נמען.
בזאת אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (~ 2 שעות), המספק תשואה גבוהה (6-12 ~ 10 × 6 נויטרופילים / עכבר נגוע, או עד 30-40 × 10 6 נויטרופילים / עכבר נגוע) של (80 טהורים -95%) נויטרופילים עם> כדאיות 95% ממח העצם. שיטה זו משתמשת Histopaque זמין באופן מסחרי, שהם נפרדים תא שיפוע צפיפותתקשורת מזון בהיקף של Ficoll וdiatrizoate נתרן, כדי להפריד בין נויטרופילים ממח העצם של עכברים. שיטה זו מניבה מספרים גדולים יותר באופן משמעותי של נויטרופילים לכל עכבר בהשוואה לדם או חלל הצפק, זה יכול לשמש כדי לאסוף נויטרופילים מעכברים הן במצב יציב או לאחר הדבקה, וזה קל יותר לשכבה בהשוואה לשיטת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות המשתמשת רציף הדרגתיים Percoll בהיקף של 55% / 65% / 75% בPercoll PBS 9. בנוסף, הזמן והמשאבים הנדרשים לאיסוף נויטרופילים טהורים הם ירדו באופן משמעותי בהשוואה לבידוד נויטרופילים באמצעות מיון תא הקרינה המופעל. כמו כן, מכיוון ששיטה זו אינה כרוכה בצעד העשרת immunomagnetic, זה יותר יעיל וחסכוני, וזה ימנע את החשיפה של תאים לעמודה ונוגדנים מגנטיים, וכך להקטין את הסבירות להפעלת נויטרופילים.
בנוסף לביצוע מחקרים תפקודיים של neutroph המבודדILS לשעבר vivo והעברת מאמצת של תאים לעכברים נמען, פרוטוקול זה גם מתאר שיטה לתיוג של נויטרופילים המבודדים באמצעות צבעי CellTracker שונים. תיוג ההפרש של נויטרופילים מעכברים של רקע גנטי שונים יכול להיות מותאם במחקרי Repopulation התחרותיים למעקב אחר נויטרופילים שהועברו ברקמות של עכברי נמען באמצעות cytometry זרימה, אשר יכול לספק תובנה מכניסטית בתפקיד הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם ליעד איברים מודלקים 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד של תאים במח עצם עכבר
- להרדים עכברים תוך שימוש בפרוטוקול הטיפול בבעלי החיים של המוסד אישרה ועדה ולרסס את פני השטח החיה עם 70% אתנול.
- עושה חתך בעור באמצע הבטן, ולהסיר את העור מחלק הדיסטלי של העכבר כולל העור המכסה את הגפיים התחתונים.
- חותכים את השרירים מהגפיים התחתונים באמצעות מספריים ולנקוע זהירות מרחשת ממפרק הירך, תוך הימנעות מלשבור את ראש עצם הירך.
- הסר את השרירים שנותרו מעצם הירך ועצם השוק באמצעות אזמל ומספריים ולהפריד את עצם הירך מעצם השוק בטיפול בפעילות גופנית מפרק הברך לא לשבור את קצות העצם. מניחים את העצמות בצלחת פטרי המכילה RPMI קר כקרח 1640 1X בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- להמשיך לשלבים הבאים מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה. לנקוט אמצעי זהירות נוסף כדי לשמור על טכניקות סטריליות מחמירות כדי להימנע מneutrophiהפעלת ליטר.
- יש לשטוף את כל עצמות עם אתנול 70% (בתוך צלחת פטרי) ואחרי שלושה שוטף הבאים בPBS סטרילי קר כקרח (בתוך צלחות פטרי) כדי לשטוף את אתנול מפני השטח של העצמות.
- בתוך צלחת פטרי סטרילית נקיות, לחתוך את אפיפיזות של העצמות ולשמור אותם בצד.
- שימוש במחט 25 מד ומזרק 12 סמ"ק מלאים RPMI השלים עם FBS 10% ו2 מ"מ EDTA, ולשטוף את תאי מח העצם משני הקצוות של פירי העצם על שפופרת 50 מיליליטר בורג עליון פלקון מצוידת עם 100 מיקרומטר לסנן. כדי להסיר ביעילות את כל התאים, לגרד את פני השטח הפנימיים של העצמות באמצעות מחט 25 מד.
הערה: חליטה של עצמות מצביעה על כך שהתאים כבר גרד מספיק.
הערה: השתמש כ 10 מ"ל של תקשורת כדי לשטוף זוג שוקה ירך /. הוספת EDTA למדיום היא חיונית כדי למנוע יצירת גושים של התאים.
- חותכים את עצם אפיפיזותב 3 חתיכות קטנות 0.5-1 מ"מ עם אזמל ולנפץ אותם דרך מסנן 100 מיקרומטר באמצעות הקצה האחורי של 2.5 מ"ל אפנדורף Combitip פלוס קצה פיפטה Biopur.
- צנטריפוגה ב -1,400 סל"ד במשך 7 דקות ב 4 ° C.
- Lyse את כדוריות הדם האדומים על ידי resuspending התא גלולה ב 20 מ"ל של 0.2% NaCl לכ 20 שניות אחריו תוספת של 20 מ"ל של 1.6% NaCl. (קריטי: לא יעלה על 20-30 שניות של תמוגה hypotonic כדי למנוע מוות של תאי מוח עצם השימוש בhypotonic NaCl לתמוגה מומלץ על חיץ lysing ACK משום שהאחרון יש הפוטנציאל להפעיל את נויטרופילים.).
- צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 1400 סל"ד ב 4 ° C כדי לאסוף את התאים.
- שטוף תאים עם RPMI 1X 1640 בתוספת 10% FBS ו 2 מ"מ EDTA וצנטריפוגות כמו בשלב 1.12.
- התשואה של תאים במח עצם בשיטה זו היא כ 60-80,000,000 לC57BL בן שבוע 8-12 נגוע / 6 עכבר.
2. הפרדה של נויטרופיליםעל ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות
- ספירת תאי מח העצם וresuspend ב 1 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח.
- הוסף 3 מ"ל של Histopaque 1119 (צפיפות, 1.119 גרם / מ"ל) בצינור חרוטי 15 מ"ל.
- שכבת 3 מ"ל של Histopaque 1077 (צפיפות, 1.077 גרם / מ"ל) ב 3 מ"ל של Histopaque 1119.
הערה: Histopaque 1119 וHistopaque 1077 יש לחמם ל18-26 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
שלב קריטי: הכן הדרגתיים מייד לפני שימוש כהכנת השיפוע מראש יגרום לדיפוזיה בין שתי השכבות וטוהר נויטרופילים הכי מוצלח והתאוששות.
שלב קריטי: כיסה Histopaque 1077 על 1119 שצריכים להיעשות באיטיות על מנת להימנע מערבוב שתי הצפיפויות, אשר ימנעו הפרדת תא במהלך צנטריפוגה.
- כיסוי ההשעיה תא מוח העצם על גבי Histopaque 1077.
שלב קריטי: Overlaying ההשעיה תא מוח העצם מעל 1077 הצרכים Histopaque להיעשות באיטיות על מנת למנוע הפרעה לממשק בין התאים וHistopaque 1077.
הערה: resuspending תאי מח עצם מעכבר נגוע ב1 מ"ל של PBS מניב טוהר של נויטרופילים> 90%. עם זאת, איגום דגימות מח עצם רבים פוגע בטוהר נויטרופילים, למשל, resuspending 300 x 10 6 תאים ב3 מ"ל PBS מפחית טוהר נויטרופילים מ> 90% ל ~ 80%. לכן, חוקרים צריכים לבצע ניסויי פיילוט על מנת לזהות את התנאים לספור / נפח התא האידיאלי עבור הניסויים הספציפיים שלהם
- צנטריפוגות במשך 30 דקות ב -2,000 סל"ד של 25 מעלות צלזיוס, ללא בלם.
הערה: צנטריפוגה של הצבע בטמפרטורת חדר היא קריטית וחיונית להפרדה יעילה של נויטרופילים.
- לאסוף את הנויטרופילים בממשק של 1119 Histopaque וHistopaque 1077 שכבות. שטוף את הנויטרופילים נאספו פעמיים עם RPMI 1640 1X בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ו צנטריפוגות ב -1,400 סל"ד במשך 7 דקות ב 4 ° C.
- לספור את הנויטרופילים ולקבוע הכדאיות שלהם.
הערה: נויטרופילים הם בדרך כלל> 95% קיימא ו> 90% טהורים, כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS. התשואה הטיפוסית של נויטרופילים ממח העצם (עצם ירך 2 כלומר 2 ועצמות שוקה) של C57BL בן שבוע 8-12 נגוע / 6 תאי עכבר היא ~ 6-12,000,000. מספר זה הוא באופן משמעותי יותר כאשר נויטרופילים נקצרים ממח עצם של בעלי חיים נגועים. לפיכך, ~ מיליון נויטרופילים / עכבר 30-40 התגלו כאשר עכברים נגועים בקנדידה שמשו לקצירת תא 6.
3. תיוג של נויטרופילים באמצעות צבעי CellTracker
- Resuspend את הנויטרופילים ב5 x 10 6 תאים / מ"ל PBS prewarmed על 37 ° C.
- הוסף צבע CellTracker בconcent סופימנה של 5 מיקרומטר.
הערה: CellTracker גרין (CMFDA (diacetate 5 Chloromethylfluorescein) וCellTracker אורנג' (CMTMR (5 - (ו- 6)-4-Chloromethyl Tetramethylrhodamine אמין בנזואיל) היה בשימוש בפרוטוקול זה כדי לתייג נויטרופילים באופן דיפרנציאלי מהסוג פרוע וגן לקוי עכברים.
הערה: הכן פתרון המניות של 10 מ"מ של גרין CellTracker וCellTracker אורנג', aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד היום של הניסוי.
- דגירה נויטרופילים עם 5 מיקרומטר של צבע CellTracker המקביל למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועדים בחושך.
- שטוף פעמיים עם תאי RPMI 1X 1640 קר כקרח בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
הערה: כביסה יעילה של התאים לאחר צעד התיוג עם צבע CellTracker הוא חיוני, כדי למנוע זיהום צולב צבע לפני ערבוב אוכלוסיות נויטרופילים דיפרנציאלי שכותרת לירידותמחקרי Repopulation תחרותיים tream.
4. העברת מאמצת של נויטרופילים בעכברים ובניתוח של נויטרופילים המועברים באמצעות cytometry זרימה
- נויטרופילים Resuspend ב קר כקרח PBS בריכוז של 25 x 10 6 תאים / מ"ל ולהזריק 200 μl של ההשעיה לוריד הזנב לרוחב כך ש5 x 10 6 נויטרופילים מועברים לכל עכבר. ללימודי נויטרופילים Repopulation תחרותיים, לערבב נויטרופילים wild-type והגן לקויים בביחס 1:1 ולהזריק כולל של 5 x 10 6 נויטרופילים לכל עכבר כאמור לעיל.
הערה: לפחות עד 10 x 10 6 נויטרופילים ניתן להעביר adoptively לכל עכבר ללא רעילות מיידית ברורה לבעלי החיים.
- בזמנים שונים לאחר העברת מאמצת (למשל 1, 2, 3 או 4 שעות שלאחר העברה), להרדים עכברים ודם קציר, ו / או מח עצם ו / או איבר המטרה אחר (ים) של עניין.
- הכן את siהשעיות ngle סלולריים מרקמות אלה לניתוח כמותי ואיכותי של נויטרופילים הועברו adoptively כותרתו תוך שימוש בפרוטוקולים שפורסמו 6,15.
- בעקבות צביעה חי / מת כדאיות וסגר FC, תאי תווית עם CD45 (שיבוט 30-F11), Ly6G (שיבוט 1A8) וCD11b (שיבוט M1/70) ושער בשידור החי בCD45 + + Ly6G CD11b + נויטרופילים. נויטרופילים בשער זה כוללים נויטרופילים ילידים של עכבר הנמען, כמו גם את נויטרופילים שהכותרת הועבר adoptively, שהם + FITC (אם מסומן עם CellTracker הירוק) או PE + (אם תווית עם מעקב הסלולרי אורנג').
הערה: נויטרופילים עשויים להיות במעקב בדם, מח עצם וכליה של עכברים נגועים בקנדידה להעברה לאחר לפחות 4 שעות.
הערה: קיבוע עם paraformaldehyde 2% ב-PBS אינו משפיע על עוצמת הקרינה הממוצעת של נויטרופילים שכותרתו עם Gr CellTracker רעהeen או CellTracker אורנג' לפחות 48 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה הוא מותאם לקציר של תאים במח עצם מעכברים וההפרדה הבאה של נויטרופילים מתאי אלה על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות באמצעות מדיה הפרדת תא Histopaque זמינה מסחרי. נויטרופילים מבודדים באמצעות שיטה זו יכולה לשמש למגוון רחב של מחקרי vivo לשעבר התפקודי במורד הזרם ולניסויים בהעברת מאמצת עכברי נמען.
התשואה אופיינית לאוסף של תאים במח עצם משני עצמות ירך ועצם שוק לכל עכבר 8-12 C57BL / 6 בן שבוע נגוע היא ~ 60-80,000,000 תאים עם יכולת קיום של ~ 94-98%. צנטריפוגה שיפוע צפיפות במורד הזרם של התאים האלה באמצעות תקשורת הפרדת צפיפות Histopaque בדרך כלל תשואות ~ מיליון נויטרופילים 6-12 לכל עכבר נגוע. הנויטרופילים הם 80-95% טהורים ו> 95% קיימא, כפי שאומתו על ידי cytometry זרימה (איור 1). למרות שניתן לתאי מח עצם בריכת מכמה בעלי חיים לפני שהצפיפותצעד צנטריפוגה שיפוע, תאי איגום מעט מקטין את טוהר של נויטרופילים המבודדים. לדוגמה, בעוד שכיסה 60-80,000,000 תאי מח עצם מעכבר אחד נגוע ב1-3 מ"ל של PBS תשואות> נויטרופילים טהורים 90%, את הטוהר התא יורד ל ~ 80% כאשר ~ 300 מיליון תאים במח עצם הם אספו יחד ב3 מ"ל של PBS ומעולף.
בנוסף, פרוטוקול זה גם מתאר את השלבים לתיוג הבא של נויטרופילים עם צבעי CellTracker, המאפשר מעקב של התאים שהועברו adoptively לעכברים נמען באמצעות cytometry זרימה. אינו מופיע כדי להשפיע על הישרדות נויטרופילים תיוג של נויטרופילים עם 5 מיקרומטר של CMFDA או CMTMR כנויטרופילים שכותרת יישארו> 95% קיימא (מידע לא מוצג). נויטרופילים שכותרתו עשויים להיות במעקב לתוך רקמות עכבר שונות במשך לפחות 4 שעות לאחר העברת מאמצת באמצעות cytometry זרימת gating על ידי חי CD45 + + Ly6G CD11b + תאים (איור 2).השימוש בצבעי תיוג דיפרנציאליים בנויטרופילים פראיים מסוג לעומת גן הלקויים בלימודי Repopulation תחרותיים מאפשר הערכה של התפקיד הישיר של גן מסוים (למשל chemoattractant קולט 6) בסחר של נויטרופילים מהדם אל איבר מטרה מסוימת.
איור 1. עלילת FACS נציג של נויטרופילים מבודדים מתאי במח עצם של C57BL נגוע / 6 עכבר באמצעות פרוטוקול צנטריפוגה שיפוע הצפיפות. הלוח השמאלי מדגימה gating הראשוני המשמש לתאי מח העצם שנאספו מהממשק של Histopaque 1119 ו1077 Histopaque קדימה ובאמצעות פיזור בצד (FSC / SSC). כפי שניתן לראות, נויטרופילים שנאספו מהממשק הם> 90% טהורים (פנל באמצע) ו> 95% (פנל מימין) ובת קיימא.
<IMG alt = "איור 2" src = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
איור 2. עלילת FACS נציג הועברה adoptively CMTMR שכותרת נויטרופילים שנקטפו מן הדם, מח עצם וכליות של נמען קנדידה נגוע C57BL / 6 העברה לתא הבא עכבר 4 שעות. נויטרופילים CMTMR שהכותרת הועבר adoptively הם PE-חיוביים ויכולים להיות מובחנים מ את הנויטרופילים ילידים של עכבר הנמען, שהם PE-שליליים. שים לב שהביטוי של CD11b גדול בנויטרופילים שנקטפו מהכליות לעומת הנויטרופילים נקטפו מן הדם ומוח עצם. העלייה בביטוי CD11b בנויטרופילים בכליות עולה בקנה אחד עם תוצאות קודמות 15 וכנראה משקפת הפעלה של התאים בכניסה בכליות, שהוא איבר המטרה העיקרי במודל העכבר של קנדידה המערכתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בזאת אנו מציגים פרוטוקול אמין, פשוט, מהיר וחסכוני לבידוד של מספר גדול של נויטרופילים ממח העצם של עכברים עם טוהר גבוה וכדאיות באמצעות גישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות. כאשר פרוטוקול זה מתבצע בצורה נכונה, יכולים להיות התאוששו ~ 6-12 × 10 6 נויטרופילים מעכבר נגוע ורבים כמו 30-40 ~ × 10 6 נויטרופילים עשויים להיות מבודדים מעכבר לאחר זיהום 6. את נויטרופילים הבודדים הם 80-95% טהורים ו> 95% בת קיימא.
מח עצם הוא מאגר מתאים לקבלת ללימודי נויטרופילים עכבר תפקודי במורד הזרם וניסויים העברת מאמצת. ראשית, הוא כבר הראה בעבר כי נויטרופילים מח העצם הם פונקציונלי דומים לנויטרופילים דם בעכברים שתאים משני התאים מפגינים פרץ חמצוני דומה וdegranulation 16. שנית, נויטרופילים מח עצם העכבר הוכחו לשרוד protrתקופות של הזמן פעלו בתרבות, באופן משמעותי יותר בהשוואה לנויטרופילים דם עכבר 16. לכן, קצירה של מח עצם על פני נויטרופילים בדם עלולה לאפשר לתשואה גדולה יותר של תאים, כאשר יעובדו לvivo לשעבר מבחני תפקודי. שלישית, בידוד של נויטרופילים ממח העצם מציע את היתרון של מחלים מספרים גדולים באופן משמעותי של נויטרופילים, שדי בם לניסויי העברת מאמצת במורד הזרם, הן במצב יציב ולאחר הדבקה. במקום זאת, ניתן לשחזר במידה ניכרת פחות נויטרופילים מהדם עכבר, גם לאחר הדבקה, ולא נויטרופילים רבים נמצאים במצב יציב בחלל הצפק. לפיכך, thioglycollate או סוכנים אחרים משמשים בדרך כלל כדי לקדם גיוס של נויטרופילים הופעלו בצפק; מתודולוגיה זו הקשתה על ידי טוהר המשתנה של נויטרופילים בתוך exudate הצפק החריף הדלקתי (לא פורסם, מידע לא מוצג) והגיוס של נויטרופילים הופעל phenotypדואר, שהוא שונה מזה של נויטרופילים unstimulated התאוששו מעכברי unmanipulated.
מספר שיטות זמינות עבור בידוד של נויטרופילים ממח עצם של עכברים. אלה כוללים (א) צנטריפוגה שיפוע צפיפות גישות כגון זו שאנו מציגים כאן שמשתמשת בתקשורת הפרדת צפיפות Histopaque, ומתודולוגיה דומה המשתמשת הדרגתיים Percoll רציף 17, (ב) גישות בחירת immunomagnetic חיוביות, שבמהלכו תאים במח עצם מסומנים עם נוגדנים ספציפיים לנויטרופילים כגון Ly6G, ונויטרופילים לאחר מכן מועשרים על ידי קשירה של התאים Ly6G-החיוביים על עמודה מגנטית 18, (ג) גישות immunomagnetic סלקציה שליליות, שבמהלכו תאים במח עצם מסומנים עם קוקטייל של נוגדנים אשר נקלטות בתאים אחרים מאשר נויטרופילים (כלומר CD5 ללימפוציטים מסוג T, CD45R/B220 לימפוציטים מסוג B, CD49b/DX5 לתאי NK, CD117 לתאי פיטום ותאי גזע hematopoietic, לF4/80מקרופאגים וTer119 לאריתרוציטים) 11, ולאחר מכן נויטרופילים מועשרים על ידי elution כחלק נוגדנים השלילי של תאים שאינו נקלטות על הטור המגנטי, ו( ד) הקרינה הופעל מיון תא, שבמהלכו תאים במח עצם מסומנים עם נוגדנים מלכוד שעל נויטרופילים ותאים אחרים, ונויטרופילים מופרדים אז באמצעות סדרן תא הופעל הקרינה כתאים שאינם חיוביים לסמני נויטרופילים כגון שילוב של Ly6G וCD11b.
למרות ששתי גישות לבחירת immunomagnetic חיוביות ומיון תא הופעל הקרינה לספק תשואות וpurities של נויטרופילים עכבר גבוהים מאוד, יש שיטות אלה חסרון בהשוואה לפרוטוקול שלנו שסוכני תיוג לאגד על פני השטח של נויטרופילים, אשר עלול לשנות את התפקוד שלהם. יש לי חיובי בחירת immunomagnetic גישות מגבלה הנוספת שכותרתו נוגדנים נויטרופילים לאגד על עמודה מגנטית ליםeparation, שעשוי להשפיע גם על תפקוד תא. יש מיון תא הופעל הקרינה חסרון נוסף, שזמן ארוך יותר באופן משמעותי נדרש לאוסף של התאים באמצעות סדרן תא הופעל הקרינה במתקן גרעין במעבדה, אשר עשויים להשפיע על הישרדות של נויטרופילים בשל זמן מחצית החיים הקצר שלהם לרעה. השיטה שלנו היא דומה לשיטת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות המשתמשת הדרגתיים Percoll רציף, אבל שתי שכבות תקשורת הפרדת צפיפות Histopaque מבחינה טכנית הרבה פחות מאתגרת בהשוואה לשכבות ההדרגתיות Percoll המורכב של 55%, 65% ו 75% כרך / כרך ב PBS , אשר לעתים קרובות תוצאות הערבוב של ממשקי Percoll בשל הבדלי הצפיפות הקטנים בין שלוש השכבות. בכל קשורים לבחירה שלילית immunomagnetic גישות, הם כבר דיווחו גם להיות אמינים לבידוד של מספר גדול של נויטרופילים המוסמכים תפקודיים עם טוהר גבוה ויכולת קיום ממח עצם של עכברי 11
נויטרופילים המבודדים באמצעות שיטת שיפוע הצפיפות תאר צנטריפוגה יכולים לשמש למגוון רחב של מחקרי vivo לשעבר פונקציונלי המורד כגון phagocytosis, הרג, chemotaxis, ייצור ציטוקינים, פרץ חמצוני ומבחנים באמצעות degranulation פורסם פרוטוקולים 6. בנוסף, עשויים להיות מבודדים נויטרופיליםהועבר adoptively לעכברים נגועים נמען כדי להעריך את התפקיד של העברת נויטרופילים על הישרדות עכבר ואת ההשפעות של נויטרופילים שהועברו על קושרת החיסונית כגון ייצור ציטוקינים באתרים של זיהום בעכברי נמען. לשם כך, Tosello Boari ועמיתים הועברו adoptively עצם נויטרופילים מח שמקורם בעכברים נמען Trypasonoma נגוע, שלמטה מוסדר IFN-γ ייצור בטחול ובכבד נגועים והביא לשיפור בהישרדות באופן IL-10 תלוי 19.
יתר על כן, היכולת לתייג נויטרופילים עם CellTracker הצבעים CMFDA וCMTMR ללא ירידה מושרה צבע ניכרה בכדאיויות תא מספקת הזדמנות לתייג דיפרנציאלי נויטרופילים מעכברים של רקע גנטי שונים ולעקוב אחר תאי שהכותרת הועבר adoptively באיברי המטרה שונים עכבר באמצעות זרימה cytometry או מיקרוסקופיה intravital. את צבעי CellTracker נשמרים בviablנויטרופילים והדואר לא לפזר לתאים סמוכים. במחקרים שלנו אנו משתמשים בריכוז של 5 מיקרומטר לתיוג תא ואנו מסוגלים לעקוב אחר הצלחה נויטרופילים שכותרתו בדם, מח עצם וכליות של עכברי נמען קנדידה נגועים במשך לפחות 4 שעות לאחר נויטרופילים העברה 6. חוץ מגרין וCellTracker CellTracker אורנג', צבעים אחרים, כולל יולט CellTracker, CFSE וSnarf-1 יש גם שימש בהצלחה לתווית עצם עכבר נויטרופילים מח שמקורם בניסויי העברת מאמצת 11,19,20. בנוסף, הירוק והצבע כתום CellTracker CellTracker היו בשימוש יעיל בריכוז דומה של 5 מיקרומטר לסימון תאי T טחול עכבר להעברת מאמצת ומעקב אחר ניסויים 21. היכולת לתייג באופן דיפרנציאלי נויטרופילים עם צבעי CellTracker שונים מאפשרת תכנון ניסויי Repopulation התחרותיים שבו ביחס של 1:1 של נויטרופילים מסומנים באופן דיפרנציאלי מעכברים עם שוניםרקע גנטי ניתן להעביר adoptively לעכברים נמען במטרה לקבוע את תפקידו הישיר של גנים ספציפיים בסחר של נויטרופילים מהדם אל רקמות דלקתיות. אנחנו דיווחו לאחרונה כי סחר chemokine קולט Ccr1 מתווך של נויטרופילים מהדם לכליות קנדידה נגועים בסוף הקורס של הזיהום, שתוצאתה הצטברות יתר של נויטרופילים בכליות, פגיעה ברקמות וירידה בהישרדות 6.
כמו בכל פרוטוקול, השיטה שלנו יש גם מגבלות. לדוגמה, למרות היתרונות הנ"ל של קצירת נויטרופילים ממח עצם על פני דם, יש הבדלים בולטים בין נויטרופילים שהתקבלו משני תאים אלה, אשר בהתאם ליישום המחקר במורד הזרם של התאים שנקטפו עשויה להיות השפעה על תוצאות הניסוי. באופן ספציפי, הנויטרופילים בדם תאים בוגרים, ואילו נויטרופילים מחסרונות מח העצםist משלוש אוכלוסיות שונות הנע בין promyelocytes / myelocytes בשלה לmetamyelocytes פחות בשלה / צורות להקת נויטרופילים בוגרים, כפי שתואר קודם לכן 22. לפיכך, ההבדל בגרות תא בין מח עצם ודם נויטרופילים עלול לגרום לשונות במאפיינים פונקציונליים תאים מסוימים כפי שדווח בעבר לתגובות נויטרופילים לfMLF (N-formylmethionyl-leucyl-פנילאלנין) ובליעה של חלקיקים 23. יתר על כן, כיוון שכל vivo לשעבר המניפולציה נויטרופילים עלול לגרום להפעלת תא ואפופטוזיס, זהירות היא הכרחית בעת טיפול בתאים בצנטריפוגה השיפוע. בנוסף, מכיוון שצבעי CellTracker בריכוז העולה על 5 מיקרומטר עלולים להשפיע לרעה על הישרדות נויטרופילים, אפשרות זו צריכה להיבדק בניסויי פיילוט על ידי חוקרים בודדים, תלוי במורד הזרם assay הפונקציונלי שייבחן.
לסיכום, אנו מראששלח שיטה אמינה לשחזור שיכול להיות מועסקות על ידי כל מעבדה לאסוף ולתייג מספר רב של נויטרופילים עכבר ממוח העצם. גישה זו יכולה לשמש למגוון רחב של מחקרים פונקציונליים נויטרופילים, כולל בהעברת מאמצת vivo וניסויי מעקב על ידי cytometry הזרימה ומיקרוסקופיה intravital. שימוש בזה ושל פרוטוקולים מהימנים אחרים לטיהור עכבר נויטרופילים, בידוד, תיוג והעברת מאמצת מורד הזרם ומחקרי מעקב צריך להעמיק את ההבנה של נויטרופילים פיזיולוגיה שלנו ברמה המולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר העירוני של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID), המכון הלאומי לבריאות (NIH) בארה"ב.
כל העכברים נשמרו על האגודה אמריקנית להסמכה של מתקן בעלי החיים טיפול בבעלי חיים מוכר מעבדה במכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) ושוכנו בבהתאם לנהלים המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה תחת חסותו של פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש של NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
