Summary
Vi beskriver en protokoll for isolering og rensing av nøytrofile granulocytter fra benmarg fra mus ved densitets-gradientsentrifugering og for nøytrofile merking ved hjelp CellTracker fargestoffer. Dette representerer en enkel, rask, reproduserbar og økonomisk metode for å skaffe et stort antall nøytrofile for nedstrøms funksjonelle studier eller adoptivforeldre overføring og sporing eksperimenter.
Abstract
Neutrofiler er kritiske effektorceller i det medfødte immunsystemet. De er raskt rekruttert på områder av akutt betennelse og utøve beskyttende eller patogene effekter avhengig av inflammatorisk miljø. Likevel er tross uunnværlig rolle av nøytrofile i immunitet, detaljert forståelse av molekylære faktorer som formidler nøytrofile 'effektor og immunopathogenic effekter i ulike infeksjonssykdommer og inflammatoriske tilstander fortsatt mangler, delvis på grunn av sin korte halveringstid, vanskelighetene med håndtering av disse celler og mangel på pålitelige eksperimentelle protokoller for å skaffe tilstrekkelig antall nøytrofile for nedstrøms funksjonelle studier og adoptivforeldre overføring eksperimenter. Derfor, enkel, rask, økonomisk og pålitelig metoder er svært ønskelig for høsting tilstrekkelig antall mus nøytrofile for å vurdere funksjoner som phagocytosis, drap, cytokin produksjon, degranulation og trafficking. For å nå dette målet,Vi presenterer en reproduserbar tetthetsgradient-sentrifugering-basert protokoll, som kan tilpasses i ethvert laboratorium for å isolere et stort antall neutrofiler fra benmargen hos mus med høy renhet og levedyktighet. Videre presenteres en enkel protokoll som bruker CellTracker fargestoffer for å merke de isolerte neutrofiler, som deretter kan overføres inn i mottaker-adoptively mus og sporet i en rekke vev i minst 4 timer etter overføringen ved hjelp av strømningscytometri. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan differensial merking av nøytrofile granulocytter fra villtype og gen-mangelfull mus med ulike CellTracker fargestoffer være vellykket ansatt for å utføre konkurransedyktige repopulation studier for å vurdere den direkte rolle for spesifikke gener i smugling av nøytrofile granulocytter fra blodet inn målet vev in vivo .
Introduction
Nøytrofile granulocytter er de mest tallrike leukocytter hos mennesker. De er den viktigste cellulære komponenten i det medfødte immunsystemet og fungere som en første forsvarslinje mot invaderende mikroorganismer. Pasienter med ervervet nøytropeni og primær immunsvikt som påvirker nøytrofile tall og / eller funksjon utvikle livstruende invasive bakterier og sopp, fremhever viktigheten av disse cellene i host forsvar en. Immune anerkjennelse av invaderende patogener ved infeksjon nettstedet av sine beslektede mønstergjenkjenning reseptorer resulterer i induksjon av en orkestrert medfødte immunforsvaret, noe som fører til utskillelse av chemoattractants som genererer en kjemotaktisk gradient i stand til å rekruttere nøytrofile granulocytter fra blodet inn i betent vev 2 . Etter neutrofiler inn i området infeksjon, de blir aktivert, noe som fører til cytokinproduksjon og kjemokin produksjon, patogen opptak, og dreping via oksidative og ikke-oksidative mechanisms tre. Foruten sin godt anerkjent rolle i medfødt immunitet, har nøytrofile også nylig blitt vist seg å spille en viktig rolle som pådrivere i effektive adaptive immunresponser fire. På den annen side, bortsett fra deres beskyttende roller i immunitet, kan neutrofiler også mediere vevsskade og immunopathology grunn av overdreven opphopning og / eller aktivering ved områder av betennelse, slik som vist i en rekke infeksiøse og autoimmune sykdommer 5-7.
Til tross for den uunnværlig rolle av nøytrofile granulocytter i montering effektive medfødte immunresponser og deres mitogen effektorfunksjoner i flere infeksjonssykdommer og inflammatoriske tilstander, tekniske problemer med håndtering av disse cellene og mangel på pålitelige eksperimentelle protokoller har hindret forskning med nøytrofile de siste tiårene. Derfor bør bruk av reproduserbare analyser for isolering av nøytrofile rette for videre forskning på nøytrofile-mediert immunologisk funksjon ex vivo og in vivo. Hittil har flere metoder blitt beskrevet for isolering av neutrofiler slik som tetthetsgradient-sentrifugering av humant blod og mus blod eller benmarg 8,9, positiv eller negativ immunomagnetiske anrikning av nøytrofile granulocytter fra mus blod eller benmarg 10,11, og høsting av nøytrofile granulocytter fra bukhulen til mus etter intraperitoneal injeksjon av thioglycollate eller andre 12 inflammatoriske midler. Selv nøytrofile kan enkelt isolert i stort antall fra menneskeblod, er denne metoden suboptimal i mus på grunn av begrenset volum av mus blod som utelukker isolering av tilstrekkelig nøytrofile for funksjonelle studier eller adoptivforeldre overføring eksperimenter 13. I tillegg, selv om utbyttet av thioglycollate-fremkalte celler fra bukhulen er større sammenlignet med mus blod, varierer renhet av nøytrofiler i den inflammatoriske peritoneal mellom lavage60-90%, og de isolerte nøytrofiler oppviser en aktivert fenotype. Således samles cellene ved hjelp av denne metode kan bare benyttes for å utføre funksjonelle studier av aktiverte, men ikke på neutrofiler unstimulated, som mus bukhulen har få neutrofiler i den stabile tilstanden 12.. I stedet er benmargen en praktisk reservoar for høsting store mengder enten unstimulated eller aktivert nøytrofile 11,14, som deretter kan brukes til nedstrøms funksjonelle studier som fagocytose, drap og degranulation, eller for adoptiv overføring til mottaker mus.
Heri beskriver vi en enkel og rask (~ 2 timer) protokollen, som gir en høy avkastning (~ 6-12 × 10 6 nøytrofile / infiserte mus, eller opp til 30-40 × 10 6 nøytrofile / infiserte mus) av ren (80 -95%) nøytrofile med> 95% levedyktighet fra benmargen. Denne metoden bruker kommersielt tilgjengelige Histopaque, som er tettshetsgradient celle separasjon media består av Ficoll og natrium diatrizoat, å skille nøytrofile fra benmargen hos mus. Denne metode gir betydelig større antall neutrofiler per mus sammenlignet med blod eller bukhulen, kan den brukes til å samle nøytrofiler fra mus både ved stabil tilstand eller etter infeksjon, og det er lettere å sjikt sammenlignet med tetthetsgradient-sentrifugering metode som anvender diskontinuerlige Percoll gradienter bestående av 55% / 65% / 75% Percoll i PBS 9.. I tillegg er det tid og ressurser som kreves for å samle rene nøytrofile betydelig redusert sammenlignet med nøytrofile isolasjon med fluorescens-aktivert celle sortering. Også, fordi denne metode ikke innebærer en immunomagnetiske berikelse trinnet, er det mer kostnadseffektiv, og det unngår eksponering av celler til den magnetiske kolonne og antistoffer, og dermed redusere sannsynligheten for neutrofil aktivering.
I tillegg til å utføre funksjonelle studier av isolerte neutrophils ex vivo og adoptiv overføring av cellene inn i mottaker-mus, beskriver denne protokollen også en fremgangsmåte for merking av isolerte nøytrofiler ved hjelp av ulike CellTracker fargestoffer. Differential merking av nøytrofile granulocytter fra mus i ulike genetiske bakgrunn kan tilpasses i konkurranseutsatte repopulation studier for å spore de overførte nøytrofile i vev av mottakerlandene mus ved hjelp av flowcytometri, som kan gi mekanistisk innsikt på direkte rolle for spesifikke gener i smugling av nøytrofile granulocytter fra blodet inn mål betente organer seks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Isolering av Mouse benmargceller
- Avlive mus ved hjelp av institusjonens dyr omsorg komité-godkjent protokoll og spray dyret overflaten med 70% etanol.
- Gjøre et snitt i huden på midten av buk og fjerne huden fra den distale delen av mus inkludert huden som dekker de nedre ekstremiteter.
- Skjær av muskler fra nedre ekstremiteter med saks og forsiktig forskyve en acetabulum fra hofteleddet, og samtidig unngå å bryte femur hode.
- Fjern de resterende musklene fra femur og tibia ved hjelp av en skalpell og saks og skille femur fra tibia på kneleddet trener seg til ikke å bryte bein ender. Plasser benene i en petriskål inneholdende iskald RPMI 1640 1X supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
- Fortsett til følgende trinnene under en vev kultur hette. Ta ekstra forholdsregler for å opprettholde strenge sterile teknikker for å unngå neutrophil aktivering.
- Skyll hvert ben med 70% etanol (i løpet av en petriskål) etterfulgt av tre etterfølgende vaskinger i iskald steril PBS (i petriskåler) å skylle av etanol fra overflaten av bein.
- Inne i en ren steril petriskål, avskåret epifyser av bein og holde dem til side.
- Bruke en 25 gauge nål og en 12 cc sprøyte fylt med RPMI supplert med 10% FBS og 2 mM EDTA, og spyle benmargceller fra begge endene av benene aksler på en 50 ml skrukork Falcon rør utstyrt med en 100 um filtrere. For effektivt å fjerne alle celler, skrape den indre overflate av benene ved hjelp av 25 gauge nål.
MERK: Blanchering av bein indikerer at cellene har blitt tilstrekkelig skrapt.
MERK: Bruk omtrent 10 ml av media til å spyle en femur / tibia par. Legge EDTA til mediet er viktig for å hindre klumping av cellene.
- Skjær beinet epifyseri små 0,5-1 mm 3 stykker med en skalpell og knuse dem gjennom de 100 mikrometer filter med bakenden av en 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur pipette tips.
- Sentrifuger ved 1400 rpm i 7 minutter ved 4 ° C.
- Lyser de røde blodceller ved å oppslemme cellepelleten i 20 ml 0,2% NaCl i omtrent 20 sekunder, etterfulgt av tilsetning av 20 ml 1,6% NaCl. (Kritisk: Ikke overskrid 20-30 sek av hypoton lysis å unngå benmarg celledød Bruken av hypoton NaCl for lysis er anbefalt over ACK lysebuffer fordi sistnevnte har potensial til å aktivere de nøytrofile.).
- Sentrifuge i 7 minutter ved 1400 rpm ved 4 ° C for å samle cellene.
- Vask cellene med RPMI 1640 1X supplert med 10% FBS og 2 mM EDTA og sentrifugeres som i trinn 1.12.
- Utbyttet av beinmarg celler ved hjelp av denne metoden er ca 60-80 millioner per infisert 8-12 uker gamle C57BL / 6 mus.
2. Separasjon av Neutrofilerved tetthetsgradient-sentrifugering
- Telle celler fra beinmargen og resuspender i 1 ml iskald sterile PBS.
- Tilsett 3 ml Histopaque 1119 (densitet, 1,119 g / ml) i en 15 ml konisk rør.
- Overlegg 3 ml Histopaque 1077 (densitet, 1,077 g / ml) på 3 ml Histopaque 1119.
MERK: Histopaque 1119 og Histopaque 1077 skal varmes opp til 18-26 ° C før bruk.
Kritisk trinn: forberede gradienter umiddelbart før bruk som forbereder gradient på forhånd vil resultere i diffusjon mellom de to lag og suboptimal nøytrofil renhet og utvinning.
Kritisk Step: overleggsbilder Histopaque 1077 enn 1119 må gjøres langsomt for å unngå å blande de to tettheter, som vil utelukke celleseparering under sentrifugering.
- Overlappe beinmargen celle suspensjon på toppen av Histopaque 1077.
Kritisk Step: OverlAying beinmargen celle suspensjon løpet Histopaque 1077 må gjøres langsomt for å unngå å forstyrre grensesnittet mellom cellene og Histopaque 1077.
MERK: resuspending benmargceller fra en frisk mus i 1 ml PBS gir nøytrofile renhet på> 90%. Imidlertid pooling mange beinmargsprøver kompromitterer nøytrofil renhet, for eksempel oppslemme 300 x 10 6 celler i 3 ml PBS reduserer nøytrofil renhet fra> 90% til ca 80%. Derfor bør etterforskere utføre pilotforsøk for å identifisere den ideelle celletall / volum forhold for deres spesifikke eksperimenter
- Sentrifuger i 30 minutter ved 2000 rpm ved 25 ° C uten brems.
MERK: sentrifugering av gradienten ved romtemperatur, er kritisk og viktig for effektiv separering av de nøytrofile.
- Samle nøytrofile granulocytter i grenselandet mellom den Histopaque 1119 og Histopaque 1077 lag. Vask de innsamlede nøytrofiler to ganger med RPMI 1640 1X supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin og sentrifuger ved 1400 rpm i 7 minutter ved 4 ° C.
- Tell nøytrofile og bestemme deres levedyktighet.
MERK: Neutrofiler er vanligvis> 95% levedyktige og> 90% rent som bestemt ved FACS-analyse. Den typiske utbytte av nøytrofile granulocytter fra benmargen (dvs. 2 femur og to tibia bein) av en infisert 8-12 uker gamle C57BL / 6 mus er ~ 6-12 millioner celler. Dette tallet er betydelig større når antall nøytrofile er høstet fra beinmarg fra infiserte dyr. Derfor ble ~ 30-40000000 nøytrofiler / mus gjenvinnes når Candida-infiserte mus ble brukt til cellehøstingssystem 6..
3. Merking av Neutrophils Bruke CellTracker Fargestoffer
- Resuspender neutrofilene ved 5 x 10 6 celler / ml i PBS forvarmet ved 37 ° C.
- Legg til en CellTracker fargestoff til en endelig concentrasjon av 5 mikrometer.
MERK: CellTracker Grønn (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein diacetat) og CellTracker Orange (CMTMR (5 - (and-6)-4-Chloromethyl benzoyl Amino tetramethylrhodamine) ble brukt i denne protokollen til ulikt merke nøytrofile fra vill-type og gen-mangel mus.
MERK: Forbered en stamløsning av 10 mM CellTracker Grønn og CellTracker Orange, delmengde, og oppbevar ved -80 ° C til den dagen av eksperimentet.
- Inkuber neutrofiler med 5 mM av det tilsvarende CellTracker fargestoff i 10 min ved 37 ° C i et rystende vannbad i mørket.
- Vask cellene to ganger med iskald RPMI 1640 1X supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
MERK: Effektiv vasking av cellene etter merking takt med CellTracker fargestoff er avgjørende for å unngå dye krysskontaminering før blanding differentially-merket nøytrofile populasjoner for downsTREAM konkurransedyktige repopulation studier.
4. Adoptiv Overføring av Nøytrofiler i Mus og analyse av Overførte Nøytrofiler hjelp flowcytometrisystemer
- Resuspender neutrofiler i iskald PBS ved en konsentrasjon på 25 x 10 6 celler / ml og injisere 200 ul av suspensjonen inn i den laterale halevenen slik at 5 x 10 6 nøytrofiler som overføres per mus. For konkurransedyktige repopulation nøytrofile studier, bland vill type og gen-mangelfull nøytrofile i forholdet 1:1 og injisere totalt 5 x 10 6 nøytrofile per mus som ovenfor.
MERK: Minst opptil 10 x 10 6 nøytrofile kan adoptively overføres per mus uten åpenbar umiddelbar giftighet for dyrene.
- På forskjellige tidspunkter etter adoptiv overføring (1 f.eks, 2, 3 eller 4 timers post-transfer), avlive mus og høsting av blod og / eller benmarg og / eller andre målorgan (r) av interesse.
- Forbered single cellesuspensjoner fra disse vev for kvantitativ og kvalitativ analyse av adoptively overført merket nøytrofile hjelp publisert protokoller 6,15.
- Etter levende / døde levedyktighet flekker og Fc blokade, label celler med CD45 (klone 30-F11), Ly6G (klone 1A8) og CD11b (klone M1/70) og gate på live CD45 + Ly6G + CD11b + nøytrofile. Nøytrofiler i denne gate inkluderer innfødte nøytrofiler i mottakerens mus samt adoptively overført merkede neutrofiler, som er FITC + (hvis merket med CellTracker grønt) eller PE + (hvis merket med Cell Tracker oransje).
MERK: Neutrophils kan spores i blod, benmarg og nyre av Candida-infiserte mus i minst 4 timers post-overføring.
MERK: Festes med 2% paraformaldehyde i PBS ikke påvirker den gjennomsnittlige fluorescens intensiteten av nøytrofile merket med CellTracker Green eller CellTracker Orange i minst 48 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen er optimalisert for høsting av beinmarg celler fra mus og den påfølgende separasjon av nøytrofile granulocytter fra disse cellene ved tettshetsgradient sentrifugering ved bruk av kommersielle Histopaque cellen separasjon media. Nøytrofiler isolert ved anvendelse av denne metode kan benyttes til en rekke nedstrøms funksjonelle studier ex vivo og for adoptive transfer eksperimenter i mottaker-mus.
Den typiske utbytte av samlingen av benmargceller fra både lårben og tibia per infisert 8-12 uker gamle C57BL / 6 mus er ~ 60-80 millioner celler med en levedyktighet ~ 94-98%. Nedstrøms tetthetsgradient-sentrifugering av disse cellene ved å bruke Histopaque densitetsseparasjon media gir typisk ~ 6-12000000 nøytrofiler pr uinfiserte mus. Neutrofiler er 80-95% ren, og> 95% levedyktige, som verifisert ved strømningscytometri (figur 1). Selv om det er mulig å samle benmargceller fra flere dyr før tetthetengradientsentrifugering trinn bringe sammen cellene avtar svakt renhet av de isolerte nøytrofiler. For eksempel, mens overliggende 60-80 millioner benmargceller fra en infisert mus i 1-3 ml PBS gir> 90% rene nøytrofile, reduserer celle renhet til ~ 80% når ~ 300 millioner benmargceller er samlet sammen i tre ml PBS og overlappet.
I tillegg beskriver denne protokollen også fremgangsmåten for etterfølgende merking av nøytrofile med CellTracker fargestoffer, som gjør det mulig for sporing av adoptively overførte cellene i mottakerlandene mus ved hjelp av flowcytometri. Merking av nøytrofile med 5 iM CMFDA eller CMTMR synes ikke å påvirke nøytrofile overlevelse som merket nøytrofile forblir> 95% levedyktig (data ikke vist). Merket nøytrofile kan spores til forskjellige mus vev i minst 4 timer etter adoptiv overføring ved hjelp av flowcytometri ved gating på live CD45 + Ly6G + CD11b + celler (figur 2).Bruken av differensial merking fargestoffer i villtype versus gen-mangelfull nøytrofile i konkurranse repopulation studier åpner for vurdering av direkte rolle i et bestemt gen (f.eks chemoattractant reseptor 6) i smugling av nøytrofile granulocytter fra blodet inn i et gitt mål organ.
Figur 1. Representant FACS tomt på isolerte nøytrofile granulocytter fra benmarg celler i en infisert C57BL / 6 mus med tettshetsgradient sentrifugering protokollen. Det venstre panelet viser den første gating brukes for benmargceller samlet inn fra grensesnittet av Histopaque 1119 og Histopaque 1077 ved hjelp fremover og side scatter (FSC / SSC). Som vist, nøytrofile samlet inn fra grensesnittet er> 90% rent (midtre panelet) og> 95% levedyktig (høyre panel).
<img alt = "Figur 2" src = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
Figur 2. Representant FACS tomt på adoptively overført CMTMR-merket nøytrofile høstet fra blod, benmarg og nyrer av en mottaker Candida-infisert C57BL / 6 mus fire hr følgende celle overføring. Den adoptively overført CMTMR-merket nøytrofile er PE-positive og kan skilles fra de innfødte nøytrofile til mottakeren mus, som er PE-negative. Legg merke til at uttrykket av CD11b er større i nøytrofile høstet fra nyrene i forhold til nøytrofile høstet fra blod og benmarg. Økningen i CD11b ekspresjon i nyre neutrofiler er i samsvar med tidligere resultater 15 og sannsynlig reflekterer aktivering av cellene ved registrering i nyrene, noe som er det viktigste målorganet i musemodellen for systemisk candidiasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri vi presenterer en pålitelig, enkel, rask og økonomisk protokoll for isolering av et stort antall nøytrofile granulocytter fra benmargen hos mus med høy renhet og levedyktighet ved hjelp av en densitetsgradient sentrifugering tilnærming. Når denne protokollen er utført riktig, kan ~ 6-12 × 10 6 nøytrofile gjenopprettes fra en infisert mus og så mange som ~ 30-40 × 10 6 nøytrofile kan isoleres fra en mus etter smitte seks. De isolerte nøytrofile er 80-95% ren og> 95% levedyktig.
Benmargen er et egnet reservoar for å skaffe mus nøytrofile for nedstrøms funksjonelle studier og adoptivforeldre overføring eksperimenter. For det første har det tidligere blitt vist at benmarg neutrofile funksjonelt lik blodneutrofiler i mus som celler fra begge seksjonene viser lignende oksidativ brist og degranulering 16.. Sekund, har mus benmarg nøytrofile vist seg å overleve protrhandlet perioder i kultur, betydelig lengre i forhold til mus blodneutrofiler 16. Derfor kan høsting av benmarg løpet blodneutrofiler tillate større utbytte av cellene når behandlet for funksjonelle analyser ex vivo. Tredje, isolering av nøytrofile granulocytter fra benmargen har fordelen av å utvinne betydelig større antall nøytrofile, som er tilstrekkelig for nedstrøms adoptivforeldre overføring eksperimenter, både ved steady state og etter smitte. I stedet kan betydelig færre nøytrofile gjenopprettes fra mus blod, selv etter smitte, og ikke mange nøytrofile er til stede ved steady state i bukhulen. Dermed er thioglycollate eller andre agenter vanligvis brukes til å fremme rekruttering av aktiverte nøytrofile i bukhule; denne metodikken er hemmet av den variable renhet av nøytrofile innenfor peritoneal akutt inflammatorisk eksudat (upubliserte, data ikke vist) og induksjon av en aktivert nøytrofile phenotype, som er forskjellig fra unstimulated nøytrofile utvinnes fra umanipulerte mus.
Flere metoder er tilgjengelige for isolering av nøytrofile granulocytter fra benmarg hos mus. Disse omfatter (a) tetthetsgradient-sentrifugering nærmer slik som den vi presenterer her som bruker Histopaque densitetsseparasjon medier, og en lignende metode som bruker diskontinuerlig Percoll gradienter 17, (B) positive immunomagnetiske utvalg metoder, der benmargceller er merket med en nøytrofile-spesifikt antistoff som Ly6G, og nøytrofile blir så beriket av binding av Ly6G-positive celler i et magnetisk kolonne 18, (c) negativ seleksjon immunomagnetiske tilnærminger, der benmargceller er merket med en cocktail av antistoffer som binder på celler andre enn nøytrofile (dvs. CD5 for T-lymfocytter, CD45R/B220 for B-lymfocytter, CD49b/DX5 for NK-celler, CD117 for mastceller og blodkreft stamceller, F4/80 formakrofager og Ter119 for erytrocytter) 11, og deretter nøytrofiler er beriket med eluering som den antistoff-negative fraksjon av celler som ikke binder på den magnetiske spalte, og (d) Fluorescence Activated Cell Sorting, i løpet av hvilken benmargceller er merket med antistoffer som binder på neutrofiler og andre celler, og nøytrofile blir deretter separert ved hjelp av et Fluorescence Activated Cell Sorter som de celler som er positive for nøytrofile markører som for eksempel kombinasjonen av Ly6G og CD11b.
Selv om både positive immunomagnetiske utvalg tilnærminger og fluorescens aktivert celle sortering gi svært høy avkastning og renheter av mus nøytrofile, disse metodene har den ulempe i forhold til vår protokoll som merking agenter binde på overflaten av nøytrofile, som potensielt kan endre sin funksjon. Positive immunomagnetiske utvalg tilnærminger har den ekstra begrensning at antistoff-merket nøytrofile binder på en magnetisk kolonnen for separation, som også kan påvirke cellefunksjonen. Fluorescens aktivert celle sortering har den ekstra ulempe at vesentlig lengre tid er nødvendig for innsamling av cellene ved hjelp av en fluorescens aktivert celle sorter i et laboratorium kjerne anlegget, noe som kan påvirke overlevelsen av nøytrofile granulocytter på grunn av sin korte halveringstid. Vår fremgangsmåte er sammenlignbar med den tetthetsgradient-sentrifugering metode som anvender diskontinuerlige Percoll gradienter, men lagdeling de to Histopaque densitetsseparasjon media er teknisk mye mindre krevende forhold til lagdeling av Percoll gradienter som består av 55%, 65% og 75% vol / vol i PBS , som ofte resulterer i sammenblanding av Percoll-grensesnitt på grunn av liten tetthet forskjellene mellom de tre lag. Med hensyn til negative immunomagnetiske valg tilnærminger, har de også blitt rapportert å være egnet for isolering av store mengder av funksjonelt vedkommende neutrofiler med høy renhet og levedyktighet fra benmarg hos mus 11
Isolerte neutrofiler ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering som beskrevet fremgangsmåte kan anvendes for en rekke nedstrøms funksjonelle studier ex vivo, slik som fagocytose, dreping, kjemotaksis, cytokin produksjon, oksidativ brist og degranulation analyser ved hjelp av publiserte protokoller 6.. I tillegg kan det isolerte neutrofiler bliadoptively overført til mottaker infiserte mus for å vurdere betydningen av nøytrofile overføring på mus overlevelse og effekter av overførte nøytrofile på immunologiske korrelater som cytokin produksjon på nettstedene til infeksjon i mottakerlandene mus. For å nå dette målet, Tosello Boari og kolleger adoptively overført benmarg-avledet nøytrofile inn Trypasonoma-infiserte mottaker mus, noe som nedregulert IFN-γ produksjon i infisert milt og lever, og resulterte i bedret overlevelse i en IL-10 avhengig måte 19.
Videre gir muligheten til å merke nøytrofile med CellTracker fargestoffer CMFDA og CMTMR tilsynelatende uten dye-indusert reduksjon i celle levedyktighet en mulighet til ulikt merke nøytrofile granulocytter fra mus i ulike genetiske bakgrunn og spore adoptively overført merkede celler i forskjellige mus målorganer ved hjelp av strøm cytometry eller intravital mikroskopi. De CellTracker fargestoffer beholdes i viable nøytrofile og ikke spres til tilstøtende celler. I våre studier bruker vi en konsentrasjon av fem mikrometer for celle merking, og vi er i stand til å spore merket nøytrofile i blod, benmarg og nyrer av Candida-infiserte mottaker mus i minst 4 timer etter nøytrofile overføring seks. Foruten CellTracker Grønn og CellTracker Orange, andre fargestoffer inkludert CellTracker Violet, CFSE og Snarf-en har også blitt brukt med hell til etiketten mus benmarg-avledet nøytrofile for adoptivforeldre overføring eksperimenter 11,19,20. I tillegg har CellTracker Grønn og CellTracker Orange fargestoffer blitt effektivt brukt på en lignende konsentrasjon av fem mikrometer for merking mus spleniske T-celler for adoptiv overføring og sporing eksperimenter 21. Evnen til å merke differensielt nøytrofiler med ulike CellTracker fargestoffer gir mulighet for å utforme repopulation konkurrerende eksperimenter hvor et 1:1 forhold av differensielt merkede nøytrofile celler fra mus med forskjelligegenetiske bakgrunn kan adoptively overført til mottaker mus med sikte på å fastslå den direkte rollen av spesifikke gener i smugling av nøytrofile granulocytter fra blodet inn i betent vev. Vi har nylig rapportert at kjemokin reseptoren CCR1 medierer omsetning av nøytrofile granulocytter fra blodet til Candida-infiserte nyrer sent i løpet av infeksjon, resulterer dette i overdreven akkumulering av nøytrofiler i nyre, vevskade og redusert overlevelse 6..
Som med enhver protokoll, har vår metode også begrensninger. For eksempel, til tross for de ovennevnte fordeler ved å høste nøytrofile granulocytter fra benmarg enn blod, er det betydelige forskjeller mellom nøytrofile celler er fremstilt av disse to rom, hvilket avhengig av den nedstrøms forskning anvendelsen av de høstede cellene kan ha en innvirkning på forsøksresultatene. Spesielt blodneutrofiler er modne celler, mens nøytrofile granulocytter fra benmargen consist av tre ulike subpopulasjoner som spenner fra umodne promyelocytes / myelocytter til mindre umodne metamyelocytter / bandet skjemaer til modne nøytrofile, som tidligere beskrevet 22. Derfor kunne forskjellen i celle modenhet mellom benmarg og blod nøytrofile føre til variasjon i bestemte celler funksjonelle egenskaper som det ble tidligere rapportert for nøytrofile svar på fMLF (N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanin) og inntak av partikler 23. Videre, fordi noen nøytrofile manipulasjon ex vivo kan resultere i celle aktivering og apoptose, skal det utvises forsiktighet ved håndtering av cellene under gradient sentrifugering. I tillegg, fordi de CellTracker fargestoffer i konsentrasjoner større enn 5 uM kan påvirke neutrofil overlevelse, bør denne mulighet testes i pilot-forsøk med individuelle forskere, avhengig av den nedstrøms funksjonell analyse som skal testes.
I sammendraget, vi presendte en pålitelig og reproduserbar metode som kan være ansatt i ethvert laboratorium for å samle og merke et stort antall mus nøytrofile fra benmargen. Denne tilnærmingen kan brukes til en rekke nøytrofile funksjonelle studier inkludert in vivo adoptiv overføring og sporing eksperimenter ved flowcytometri og intravital mikroskopi. Bruken av dette og av andre pålitelige protokoller for mus nøytrofile rensing, isolasjon, merking og nedstrøms adoptiv overføring og sporing studier bør utdype vår forståelse av nøytrofile fysiologi på molekylært nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Divisjon for egenutført forskning av National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institute of Health (NIH) i USA.
Alle musene ble opprettholdt på et American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care-akkreditert Dyreavdelingen ved National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) og plassert i samsvar med de prosedyrer som er skissert i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i regi av en protokoll godkjent av Animal Care og bruk komité NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
