Summary
Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.
Abstract
Los neutrófilos son las células efectoras críticas del sistema inmune innato. Ellos son reclutados rápidamente en sitios de inflamación aguda y ejercen efectos protectores o patógenos dependiendo del medio inflamatorio. No obstante, a pesar de la función indispensable de los neutrófilos en la inmunidad, la comprensión detallada de los factores moleculares que median efectos efectoras y inmunopatogénico neutrófilos 'en diferentes enfermedades infecciosas y condiciones inflamatorias que aún falta, en parte debido a su corta vida media, las dificultades con la manipulación de estos las células y la falta de protocolos experimentales fiables para la obtención de un número suficiente de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo y los experimentos de transferencia adoptiva. Por lo tanto, los métodos simples, rápidos, económicos y fiables son muy deseables para la recolección de un número suficiente de los neutrófilos de ratón para evaluar funciones como la fagocitosis, la matanza, la producción de citoquinas, degranulación y la trata. Para ese fin,se presenta un protocolo basado en centrifugación de gradiente de densidad reproducible, que se puede adaptar en cualquier laboratorio para aislar un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y viabilidad. Por otra parte, se presenta un protocolo simple que utiliza colorantes CellTracker para etiquetar los neutrófilos aislados, que pueden entonces ser transferidos de manera adoptiva en ratones receptores y rastreados en varios tejidos durante al menos 4 horas después de la transferencia usando citometría de flujo. El uso de este enfoque, el etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de tipo salvaje y deficiente en el gen con diferentes colorantes CellTracker se puede emplear con éxito para llevar a cabo estudios de repoblación competitivos para evaluar el papel directo de los genes específicos en el tráfico de los neutrófilos de la sangre a los tejidos diana in vivo .
Introduction
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en los seres humanos. Ellos son el principal componente celular del sistema inmune innato y actúan como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los pacientes con neutropenia adquirida y las inmunodeficiencias primarias que afectan el número de neutrófilos y / o la función de desarrollar infecciones bacterianas y fúngicas invasoras que amenazan la vida, destacando la importancia de estas células en la defensa de acogida 1. El reconocimiento inmune de patógenos invasores en el sitio de la infección por sus receptores de reconocimiento de patrones resultados análogos en la inducción de una respuesta inmune innata orquestada, lo que conduce a la secreción de factores quimiotácticos que generan un gradiente quimiotáctico capaz de reclutar neutrófilos de la circulación sanguínea en el tejido inflamado 2 . Después de neutrófilos entran en el sitio de la infección, que se activan, lo que conduce a la producción de citoquinas y quimioquinas, la absorción de patógeno, y matar a través de mí oxidativo y no oxidativocanismos 3. Además de su papel bien conocido en la inmunidad innata, los neutrófilos también se ha demostrado recientemente para desempeñar papeles importantes como iniciadores de la respuesta inmune adaptativa eficaces 4. Por otro lado, además de sus funciones de protección en la inmunidad, los neutrófilos también pueden mediar la lesión tisular e inmunopatología debido a la acumulación excesiva y / o la activación a sitios de inflamación, como se muestra en una variedad de enfermedades infecciosas y autoinmunes 5-7.
A pesar del papel indispensable de los neutrófilos en el montaje de la respuesta inmune innata eficaces y sus funciones efectoras pleiotrópicos en varias enfermedades infecciosas y afecciones inflamatorias, dificultades técnicas con el manejo de estas células y la falta de protocolos experimentales fiables ha dificultado la investigación con los neutrófilos en las últimas décadas. Por lo tanto, el uso de ensayos reproducibles para el aislamiento de los neutrófilos debería facilitar aún más la investigación sobre los neutrófilos mediada por inmunofunciones de lógica ex vivo e in vivo. Hasta la fecha, varios métodos han sido descritos para el aislamiento de neutrófilos, tales como centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana y la sangre o la médula ósea del ratón 8,9, enriquecimiento inmunomagnética positivo o negativo de los neutrófilos de la sangre o la médula ósea del ratón 10,11, y la cosecha de los neutrófilos de la cavidad peritoneal de los ratones después de la inyección intraperitoneal de tioglicolato o otros agentes inflamatorios 12. Aunque los neutrófilos pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades a partir de sangre humana, este método es subóptima en ratones debido al volumen limitado de sangre de ratón que se opone a aislamiento de neutrófilos suficientes para estudios funcionales o experimentos de transferencia adoptiva 13. Además, aunque el rendimiento de tioglicolato-suscitó las células de la cavidad peritoneal es mayor en comparación con la de la sangre del ratón, la pureza de los neutrófilos en el lavado peritoneal inflamatoria varía entre60-90%, y los neutrófilos aislados exhiben un fenotipo activado. Por lo tanto, las células recogidas usando este método sólo se puede utilizar para llevar a cabo estudios funcionales de activado, pero no de los neutrófilos no estimulados, como la cavidad peritoneal del ratón tiene pocos neutrófilos en el estado estacionario 12. En su lugar, la médula ósea es un depósito conveniente para la recolección de un gran número de neutrófilos no estimulados o activados ya sea 11,14, que luego se pueden utilizar para los estudios funcionales aguas abajo tales como la fagocitosis, la desgranulación y la matanza, o para la transferencia adoptiva en ratones receptores.
Aquí se describe un protocolo simple y rápido (~ 2 h), que proporciona un alto rendimiento (~ 6-12 × 10 6 neutrófilos / ratón no infectado, o hasta 30-40 × 10 6 neutrófilos / ratón infectado) puro de (80 -95%) los neutrófilos con> 95% de viabilidad de la médula ósea. Este método utiliza Histopaque disponibles comercialmente, que son la densidad de separación celular gradientemedios de racionamiento que consisten de Ficoll y diatrizoato de sodio, para separar los neutrófilos desde la médula ósea de los ratones. Este método produce un número significativamente mayor de neutrófilos por ratón en comparación con la sangre o la cavidad peritoneal, que puede ser utilizado para recoger los neutrófilos de ratones, tanto en estado estacionario o después de la infección, y es más fácil a la capa en comparación con el método de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo que utiliza gradientes de Percoll que consisten de 55% / 65% / 75% de Percoll en PBS 9. Además, el tiempo y los recursos necesarios para recoger los neutrófilos puras se redujo significativamente en comparación con el uso de aislamiento de neutrófilos activados por fluorescencia de clasificación de células. También, ya que este método no implica una etapa de enriquecimiento inmunomagnética, es más rentable, y que evita la exposición de las células a la columna magnética y anticuerpos, disminuyendo así la probabilidad de activación de neutrófilos.
Además de realizar estudios funcionales de neutroph aisladoILS ex vivo y la transferencia adoptiva de células en ratones receptores, este protocolo también describe un método para el etiquetado de los neutrófilos aislados utilizando diferentes colorantes CellTracker. Etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de diferentes orígenes genéticos se puede adaptar en los estudios de repoblación competitivos para el seguimiento de los neutrófilos transferidos en los tejidos de los ratones receptores usando citometría de flujo, que puede proporcionar una visión mecanicista sobre el papel directo de los genes específicos en el tráfico de neutrófilos de la sangre en órganos diana inflamadas 6.
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Protocol
1. Aislamiento de células de médula ósea de ratón
- La eutanasia a los ratones que usan el protocolo de cuidado de animales de la institución comité aprobado y rociar la superficie del animal con 70% de etanol.
- Hacer una incisión de la piel en la mitad del abdomen y quitar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores.
- Cortar los músculos de las extremidades inferiores con unas tijeras y dislocar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur.
- Quitar los músculos restantes del fémur y de la tibia con un bisturí y tijeras y separar del fémur de la tibia en la rodilla cuidado de las articulaciones ejercicio para no romper los extremos del hueso. Coloque los huesos en una placa de Petri que contiene medio RPMI enfriado con hielo 1640 1X suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina.
- Continúe con los siguientes pasos bajo una campana de cultivo de tejidos. Tome precauciones adicionales para mantener estrictas técnicas estériles para evitar neutrophiactivación l.
- Enjuague cada hueso con 70% de etanol (en una placa de Petri) seguido de tres lavados posteriores en PBS enfriado en hielo estéril (dentro de placas de Petri) para enjuagar el etanol a partir de la superficie de los huesos.
- Dentro de una caja de Petri estéril limpio, cortar las epífisis de los huesos y mantener a un lado.
- Utilice una aguja de calibre 25 y una jeringa de 12 cc llena con medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 2 mM de EDTA, y lavar las células de médula ósea de ambos extremos de los ejes de hueso en un tornillo ml de la tapa del tubo Falcon de 50 equipado con un 100 micras filtrar. Con el fin de eliminar de manera eficiente todas las células, raspar la superficie interna de los huesos usando la aguja de calibre 25.
NOTA: El blanqueo de los huesos indica que las células han sido suficientemente raspado.
NOTA: Utilice aproximadamente 10 ml de medio para eliminar un fémur / la tibia par. Adición de EDTA para el medio es esencial para evitar la aglutinación de las células.
- Cortar las epífisis óseasen pequeños pedazos 0.5-1 mm 3 con un bisturí y aplastar a través del filtro de 100 micras utilizando la parte de atrás de un 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur punta de pipeta.
- Centrifugar a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C.
- Lisar las células rojas de la sangre mediante la resuspensión del sedimento celular en 20 ml de NaCl al 0,2% durante aproximadamente 20 segundos seguido por la adición de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: No exceda 20-30 segundos de lisis hipotónica para evitar la muerte de células de médula ósea se recomienda el uso de NaCl para la lisis hipotónica sobre tampón de lisis ACK ya que este último tiene la posibilidad de activar los neutrófilos.).
- Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recoger las células.
- Lavar las células con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 2 mM de EDTA y se centrifuga como en el paso 1,12.
- El rendimiento de células de médula ósea utilizando este método es aproximadamente un 60-80 millones por no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 de ratón.
2. La separación de neutrófilospor centrifugación en gradiente de densidad
- Contar las células de médula ósea y resuspender en 1 ml de PBS enfriado en hielo estéril.
- Añadir 3 ml de Histopaque 1119 (densidad, 1,119 g / ml) en un tubo cónico de 15 ml.
- Superposición de 3 ml de Histopaque 1077 (densidad, 1,077 g / ml) en el 3 ml de Histopaque 1119.
NOTA: Histopaque 1119 y Histopaque 1077 se deben calentar a 18-26 ° C antes de su uso.
Paso Crítico: Preparar gradientes inmediatamente antes de su uso como la preparación de la gradiente de antemano dará lugar a la difusión entre las dos capas y la pureza y la recuperación de neutrófilos subóptima.
Paso Crítico: Superposición de Histopaque 1077 más de 1.119 necesidades que ser hecho lentamente con el fin de evitar la mezcla de las dos densidades, que se oponen a la separación de células durante la centrifugación.
- Superposición de la suspensión de células de médula ósea en la parte superior de la Histopaque 1077.
Paso Crítico: overlaying la suspensión de células de médula ósea sobre Histopaque 1077 queda mucho por hacer lentamente con el fin de evitar molestar a la interfaz entre las células y Histopaque 1077.
NOTA: La resuspensión células de médula ósea de un ratón no infectado en 1 ml de PBS produce neutrófilos pureza de> 90%. Sin embargo, la puesta en común muchas muestras de médula ósea compromete la pureza de los neutrófilos, por ejemplo, resuspendiendo x 10 6 células 300 en 3 ml de PBS reduce la pureza de neutrófilos a partir de> 90% a ~ 80%. Por lo tanto, los investigadores deben realizar experiencias piloto para identificar las condiciones de conteo / volumen celular ideal para sus experimentos específicos
- Centrifugar durante 30 min a 2000 rpm a 25 ° C sin freno.
NOTA: La centrifugación del gradiente a temperatura ambiente es crítica y esencial para la separación eficaz de los neutrófilos.
- Recoger los neutrófilos en la interfaz de la Histopaque 1119 y Histopaque 1077 capas. Lavar los neutrófilos recogidos dos veces con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina y se centrifuga a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C.
- Cuente los neutrófilos y determinar su viabilidad.
NOTA: Los neutrófilos son típicamente> 95% viable y> 90% puro según se determina por análisis FACS. El rendimiento típico de neutrófilos desde la médula ósea (es decir, 2 fémur y la tibia 2 huesos) de una no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 del ratón es ~ células 6-12.000.000. Este número es sustancialmente mayor cuando se cosechan los neutrófilos desde la médula ósea de los animales infectados. Por lo tanto, ~ 30-40 millones de neutrófilos / ratón se recuperaron cuando se utilizaron ratones infectados por Candida para la cosecha de 6 celdas.
3. Etiquetado de los neutrófilos con colorantes CellTracker
- Resuspender los neutrófilos a 5 x 10 6 células / ml en PBS precalentado a 37 º C.
- Añadir un tinte CellTracker a una concent definitivaración de 5 mM.
NOTA: CellTracker Green (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetate) y CellTracker Orange (CMTMR (5 - (y-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoilo) fue utilizada en este protocolo para etiquetar diferencialmente neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente ratones.
NOTA: Se prepara una solución madre de 10 mM de CellTracker verde y CellTracker Orange, alícuota y almacenar a -80 ° C hasta el día del experimento.
- Incubar los neutrófilos con 5 M del colorante CellTracker correspondiente durante 10 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación en la oscuridad.
- Lavar las células dos veces con helado de medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina.
NOTA: un lavado eficaz de las células después es esencial el paso marcado con el colorante CellTracker para evitar la contaminación cruzada de tinte antes de mezclar poblaciones de neutrófilos diferencialmente etiquetados para amortizacionesestudios de repoblación competitivos tream.
4. La transferencia adoptiva de neutrófilos en ratones y análisis de neutrófilos transferidos mediante citometría de flujo
- Volver a suspender las neutrófilos en PBS enfriado en hielo a una concentración de 25 x 10 6 células / ml e inyectar 200 l de la suspensión en la vena lateral de la cola de manera que 5 x 10 6 neutrófilos se transfieren por ratón. Para los estudios de neutrófilos repoblación competitivos, mezcle los neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente en una proporción de 1:1 y se inyecta un total de 5 x 10 6 neutrófilos por ratón como arriba.
NOTA: Por lo menos hasta 10 x 10 6 neutrófilos pueden adoptiva transferidos por ratón sin toxicidad evidente inmediato a los animales.
- En diferentes momentos después de la transferencia adoptiva (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 horas después de la transferencia), la eutanasia a los ratones y la sangre de la cosecha, y / o la médula ósea y / o de otro órgano diana (s) de interés.
- Preparar sisuspensiones de células NGLE de estos tejidos para el análisis cuantitativo y cualitativo de los neutrófilos transferidas adoptivamente etiquetados utilizando protocolos publicados 6,15.
- Tras la tinción vivo / muerto viabilidad y bloqueo Fc, marcar células con CD45 (clon 30-F11), Ly6G (clon 1A8) y CD11b (clon M1/70) y la puerta en vivo + CD45 + CD11b + Ly6G neutrófilos. Los neutrófilos en esta puerta incluyen neutrófilos nativas del ratón receptor, así como los neutrófilos marcados adoptivamente transferidas, que son FITC + (si etiquetado con CellTracker verde) o PE + (si etiquetado con la célula Rastreador de naranja).
NOTA: Los neutrófilos pueden ser rastreados en la sangre, la médula ósea y el riñón de los ratones infectados con Candida durante al menos 4 horas después de la transferencia.
NOTA: La fijación con 2% de paraformaldehído en PBS no afecta adversamente a la intensidad de fluorescencia media de los neutrófilos marcados con Gr. CellTrackereen o CellTracker naranja durante al menos 48 horas.
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Representative Results
Este protocolo se ha optimizado para la cosecha de células de médula ósea de los ratones y la posterior separación de los neutrófilos de estas células por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Histopaque medios de separación de células disponibles comercialmente. Los neutrófilos aislados utilizando este método se puede utilizar para una variedad de estudios de aguas abajo funcional ex vivo y para los experimentos de transferencia adoptiva en ratones receptores.
El rendimiento típico de la colección de células de médula ósea de los dos fémures y la tibia no infectada por 8-12 semanas de edad C57BL / 6 del ratón es de ~ 60 hasta 80 millones células con una viabilidad de ~ 94-98%. Aguas abajo centrifugación en gradiente de densidad de estas células utilizando los medios de separación de densidad Histopaque produce típicamente ~ 6-12.000.000 neutrófilos por ratón no infectado. Los neutrófilos son 80-95% puro y> 95% viables, tal como haya verificado por citometría de flujo (Figura 1). Aunque es posible que las células de médula ósea de la piscina de varios animales antes de la densidadetapa de centrifugación de gradiente, las células puesta en común disminuye ligeramente la pureza de los neutrófilos aislados. Por ejemplo, mientras que la superposición de 60 a 80.000.000 células de médula ósea de un ratón no infectado en 1-3 ml de PBS rendimientos> 90% de neutrófilos puros, la pureza de las células disminuye a ~ 80% cuando ~ 300 millones de células de médula ósea se agruparon en 3 ml de PBS y superpuesto.
Además, este protocolo también se describen los pasos para la rotulación posterior de los neutrófilos con colorantes CellTracker, lo que permite el seguimiento de las células transferidas adoptivamente en ratones receptores usando citometría de flujo. Etiquetado de los neutrófilos con 5 mM de CMFDA o CMTMR no parece afectar a la supervivencia de neutrófilos como los neutrófilos marcados siguen siendo> 95% viables (datos no mostrados). Neutrófilos marcados pueden ser rastreados en varios tejidos de ratón durante al menos 4 horas después de la transferencia adoptiva mediante citometría de flujo por gating en vivo CD45 + Ly6G + CD11b + células (Figura 2).El uso de diferenciales tintes de etiquetado en los neutrófilos de tipo salvaje frente a deficiente en el gen en los estudios de repoblación competitivo permite la evaluación de la función directa de un gen específico (por ejemplo, receptor de quimioatrayente 6) en el tráfico de los neutrófilos de la sangre en un órgano diana dada.
Figura 1. Representante FACS parcela de neutrófilos aislados a partir de células de médula ósea de ratones C57BL una no infectada / 6 del ratón mediante el protocolo de centrifugación en gradiente de densidad. El panel de la izquierda muestra la compuerta inicial utilizado para las células de médula ósea recogidas de la interfaz de Histopaque 1119 y 1077 utilizando Histopaque hacia adelante y hacia dispersión lateral (FSC / SSC). Como se muestra, los neutrófilos recogidos de la interfaz son> 90% pura (panel medio) y> 95% viables (panel derecho).
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Figura 2. Representante FACS parcela de adoptivamente transferido CMTMR marcados neutrófilos recolectadas de la sangre, la médula ósea y los riñones de un destinatario Candida infectados C57BL / 6 mouse horas después de la transferencia de 4 celdas. Los neutrófilos CMTMR marcados adoptiva transferidos son PE-positivos y pueden ser diferenciados de los neutrófilos nativos del ratón receptor, que son PE-negativos. Tenga en cuenta que la expresión de CD11b en neutrófilos es mayor cosechadas desde el riñón en comparación con los neutrófilos cosechadas a partir de la sangre y la médula ósea. El aumento en la expresión de CD11b en neutrófilos renales es consistente con los resultados previos 15 y probablemente refleja la activación de las células después de la entrada en el riñón, que es el principal órgano diana en el modelo de ratón de la candidiasis sistémica.
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Discussion
En este documento se presenta un protocolo fiable, sencillo, rápido y económico para el aislamiento de un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y la viabilidad utilizando un enfoque de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrófilos pueden ser recuperados de un ratón no infectado y un máximo de ~ 30-40 × 10 6 neutrófilos pueden aislarse a partir de un ratón después de la infección 6. Los neutrófilos aislados son 80-95% puro y> 95% viables.
La médula ósea es un depósito adecuado para la obtención de los neutrófilos de ratón para el estudio funcional de aguas abajo y los experimentos de transferencia adoptiva. En primer lugar, se ha demostrado previamente que los neutrófilos de médula ósea son similares funcionalmente a los neutrófilos de la sangre en ratones como las células de ambos compartimentos exhiben estallido oxidativo similar y la desgranulación de 16. En segundo lugar, los neutrófilos de médula ósea de ratón han mostrado que sobreviven protrperíodos actuado de tiempo en la cultura, significativamente mayor en comparación con ratones neutrófilos de la sangre 16. Por lo tanto, la recolección de la médula ósea sobre neutrófilos de la sangre podría permitir un mayor rendimiento de las células cuando se procesa para los ensayos funcionales ex vivo. En tercer lugar, el aislamiento de neutrófilos desde la médula ósea ofrece la ventaja de la recuperación de un número significativamente mayor de neutrófilos, que son suficientes para los experimentos de transferencia adoptiva aguas abajo, tanto en estado de equilibrio y después de la infección. En cambio, considerablemente menor de neutrófilos pueden ser recuperados de la sangre de ratón, incluso después de la infección, y no muchos neutrófilos están presentes en el estado estacionario en la cavidad peritoneal. Por lo tanto, tioglicolato u otros agentes se utilizan típicamente para promover el reclutamiento de neutrófilos activados en el peritoneo; esta metodología se ve obstaculizada por la variable de pureza de los neutrófilos en el exudado peritoneal inflamatoria aguda (datos no publicados, no se muestran) y la inducción de una neutrófilos phenotyp activadoe, que es diferente de la de los neutrófilos no estimulados recuperados a partir de ratones no manipulados.
Varios métodos están disponibles para el aislamiento de neutrófilos desde la médula ósea de los ratones. Estos incluyen (a) centrifugación en gradiente de densidad se acerca como el que se presenta aquí que utiliza medios de separación de densidad Histopaque, y una metodología similar que utiliza gradientes discontinuos de Percoll 17, (b) criterios de selección inmunomagnéticas positivos, durante el cual las células de médula ósea están etiquetados con un anticuerpo específico de los neutrófilos tales como Ly6G, y los neutrófilos se enriquece a continuación, mediante la unión de las células Ly6G-positivos sobre una columna magnética 18, (c) enfoques inmunomagnéticas de selección negativa, durante el cual las células de médula ósea se etiquetan con un cóctel de anticuerpos que se unen en células distintas de neutrófilos (es decir, CD5 para los linfocitos T, linfocitos B para CD45R/B220, CD49b/DX5 para las células NK, CD117 para los mastocitos y las células madre hematopoyéticas, para F4/80macrófagos y Ter119 para eritrocitos) 11, y a continuación, los neutrófilos son enriquecidos por elución como la fracción de anticuerpo-negativos de las células que no se unen en la columna magnética, y (d) clasificación de células activada por fluorescencia, durante el cual las células de médula ósea se marcan con anticuerpos que se unen en los neutrófilos y otras células, y los neutrófilos se separan entonces usando un Clasificador de fluorescencia de células activadas como las células que son positivas para los marcadores de los neutrófilos, tales como la combinación de Ly6G y CD11b.
Aunque ambos enfoques de selección inmunomagnéticas positivos y clasificación celular activada por fluorescencia proporcionan muy altos rendimientos y purezas de los neutrófilos de ratón, estos métodos tienen la desventaja en comparación con el protocolo que los agentes de etiquetado se unen en la superficie de los neutrófilos, lo que podría potencialmente alterar su función. Enfoques de selección inmunomagnéticas positivas tienen la limitación adicional de que anticuerpos marcados con neutrófilos se unen en una columna magnética para separation, que también puede afectar a la función celular. Clasificación celular activada por fluorescencia tiene el inconveniente adicional de que se requiere un tiempo significativamente más largo para la recogida de las células utilizando un clasificador de células activado de fluorescencia en una instalación de laboratorio central, lo que puede afectar negativamente a la supervivencia de los neutrófilos, debido a su corta vida media. Nuestro método es comparable al método de centrifugación en gradiente de densidad que utiliza gradientes de Percoll discontinuos, pero capas los dos medios de separación de densidad Histopaque es técnicamente mucho menos difícil en comparación con capas de los gradientes de Percoll que consisten en 55%, 65% y 75% v / v en PBS , que a menudo resulta en entremezclado de las interfaces de Percoll debido a las pequeñas diferencias de densidad entre las tres capas. Con respecto a los enfoques de selección inmunomagnéticas negativos, que también se han notificado a ser fiable para el aislamiento de un gran número de neutrófilos funcionalmente competentes con alta pureza y viabilidad de la médula ósea de los ratones 11
Neutrófilos aislados utilizando el método de centrifugación en gradiente de densidad descrito se pueden utilizar para una variedad de estudios de aguas abajo funcional ex vivo tales como la fagocitosis, la matanza, la quimiotaxis, la producción de citoquinas, estallido oxidativo y los ensayos de desgranulación utilizando protocolos publicados 6. Además, los neutrófilos aislados pueden sertransferida adoptivamente en ratones infectados receptores para evaluar la función de transferencia de neutrófilos en la supervivencia del ratón y los efectos de los neutrófilos transferidos sobre correlatos inmunológicos, tales como la producción de citoquinas en sitios de infección en ratones receptores. Para ese fin, Tosello Boari y colegas adoptivamente transferidas hueso neutrófilos derivadas de médula en ratones receptores Trypasonoma-infectados, que hacia abajo-regulado de IFN-γ producción en el bazo y el hígado infectado y resultó en mejora de la supervivencia de una manera dependiente de IL-10 19.
Por otra parte, la capacidad de etiquetar los neutrófilos con el CellTracker colorantes CMFDA y CMTMR sin disminución de tinte inducida aparente en la viabilidad celular proporciona una oportunidad para etiquetar diferencialmente los neutrófilos de ratones de diferentes orígenes genéticos y seguimiento de las células marcadas transferidas adoptivamente en diferentes órganos diana de ratón utilizando el flujo de citometría o microscopía intravital. Los colorantes CellTracker se retienen en hace viableneutrófilos correos y no se difunden a las células adyacentes. En nuestros estudios utilizamos una concentración de 5 mM para el etiquetado de células y que son capaces de seguir con éxito los neutrófilos marcados en la sangre, la médula ósea y los riñones de los ratones receptores infectados por Candida por lo menos 4 horas después de la transferencia de neutrófilos 6. Además CellTracker verde y CellTracker Orange, otros tintes incluyendo violeta CellTracker, CFSE y SNARF-1 también se han utilizado con éxito para la etiqueta ósea de ratón neutrófilos derivadas de médula para los experimentos de transferencia adoptiva 11,19,20. Además, el verde CellTracker y colorantes CellTracker Orange se han usado eficazmente en una concentración similar de 5 mM para la rotulación de ratón células T esplénicas para la transferencia adoptiva y el seguimiento de los experimentos 21. La capacidad para etiquetar diferencialmente los neutrófilos con diversos colorantes CellTracker permite el diseño de experimentos de repoblación competitivos en los que una proporción de 1:1 de los neutrófilos marcados diferencialmente de ratones con diferenteantecedentes genéticos pueden ser transferidos de manera adoptiva en ratones receptores con el objetivo de determinar el papel directo de los genes específicos en el tráfico de los neutrófilos de la sangre en los tejidos inflamados. Recientemente hemos informado de que el receptor de quimioquinas CCR1 media en el tráfico de los neutrófilos de la sangre a los riñones infectados con Candida tarde en el curso de la infección, lo que resulta en la acumulación excesiva de los neutrófilos en el riñón, la lesión tisular y disminución de la supervivencia 6.
Como con cualquier protocolo, nuestro método también tiene limitaciones. Por ejemplo, a pesar de las ventajas antes mencionadas de la cosecha de neutrófilos desde la médula ósea a través de la sangre, hay diferencias notables entre los neutrófilos obtenidos de estos dos compartimentos, que en función de la aplicación de la investigación posterior de las células recolectadas podría tener un impacto en los resultados experimentales. Específicamente, los neutrófilos sanguíneos son células maduras, mientras que los neutrófilos de los contras de médula óseaist de tres subpoblaciones diferentes que van desde promielocitos / mielocitos inmaduras metamielocitos menos inmaduros / formularios banda a neutrófilos maduros, como se ha descrito previamente 22. Por lo tanto, la diferencia en la madurez celular entre la médula ósea y neutrófilos de la sangre podría dar lugar a variación en ciertas características funcionales de células como se informó anteriormente para las respuestas de neutrófilos a fMLF (N-formilmetionil-leucil-fenilalanina) y la ingestión de partículas 23. Además, debido a que cualquier manipulación ex vivo de neutrófilos podría resultar en la activación celular y la apoptosis, la precaución es importante cuando se manejan las células durante la centrifugación en gradiente. Además, debido a que los colorantes CellTracker a concentraciones mayores de 5 micras podrían afectar negativamente a la supervivencia de neutrófilos, esta posibilidad debe ser probado en experimentos piloto por los investigadores individuales, dependiendo del ensayo funcional de aguas abajo que se va a probar.
En resumen, se preenviado un método fiable y reproducible que puede ser empleado por cualquier laboratorio para recoger y etiquetar un gran número de neutrófilos de ratón de la médula ósea. Este enfoque se puede utilizar para una variedad de estudios funcionales de neutrófilos, incluyendo en la transferencia adoptiva in vivo y experimentos de seguimiento por citometría de flujo y microscopía intravital. El uso de este y de otros protocolos fiables para ratón neutrófilos purificación, el aislamiento, el etiquetado y la transferencia adoptiva aguas abajo y los estudios de seguimiento debe profundizar en la comprensión de la fisiología de neutrófilos en el nivel molecular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), el Instituto Nacional de Salud (NIH), EE.UU..
Todos los ratones fueron mantenidos a una Asociación Americana para la Acreditación de la instalación para animales acreditado Cuidado de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) y alojados de conformidad con los procedimientos establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio bajo los auspicios de un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo del NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
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