Summary
Vi beskriver en protokol til isolering og oprensning af neutrofiler fra mus knoglemarv ved densitetsgradientcentrifugering og neutrofil mærkning hjælp CellTracker farvestoffer. Dette udgør en enkel, hurtig, reproducerbar og økonomisk metode til opnåelse af store antal neutrofiler til downstream funktionelle undersøgelser eller adoptiv overførsel og sporing eksperimenter.
Abstract
Neutrofiler er kritiske effektorceller i det medfødte immunsystem. De er hurtigt rekrutteret på steder af akut inflammation og udøve beskyttende eller patogene virkninger afhængigt af den inflammatoriske miljø. Ikke desto mindre er trods den uundværlige rolle neutrofiler i immunitet, detaljeret forståelse for de molekylære faktorer, der medierer neutrofiler 'effektor og immunopathogenic effekter i forskellige smitsomme sygdomme og inflammatoriske tilstande stadig mangler, dels på grund af deres korte halveringstid, vanskelighederne med håndtering af disse celler og mangel på pålidelige forsøgsprotokoller for at opnå et tilstrækkeligt antal neutrofiler for downstream funktionelle undersøgelser og adoptiv overførsel eksperimenter. Derfor enkel, hurtig, økonomisk og pålideligt metoder er særdeles ønskeligt for at høste tilstrækkeligt antal mus neutrofiler til vurdering af funktioner såsom fagocytose, drab, cytokinproduktion, degranulation og menneskehandel. Med henblik herpå,præsenterer vi en reproducerbar densitetsgradientcentrifugering-baseret protokol, der kan tilpasses i alle laboratorier at isolere et stort antal neutrofiler fra knoglemarven hos mus med høj renhed og levedygtighed. Desuden præsenterer vi en enkel protokol, der anvender CellTracker farvestoffer til at mærke de isolerede neutrofiler, som derefter kan adoptivt overføres til recipientmus og spores i flere væv i mindst 4 timer efter overførsel ved anvendelse af flowcytometri. Med denne fremgangsmåde kan differentieret mærkning af neutrofiler fra vildtype-og-gendeficient mus med forskellige CellTracker farvestoffer held kan anvendes til at udføre konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser for at vurdere den direkte rolle af specifikke gener i handel med neutrofiler fra blodet ind i målvæv in vivo .
Introduction
Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter hos mennesker. De er det vigtigste cellulære komponent af det medfødte immunsystem og fungere som en første forsvarslinje mod invaderende mikroorganismer. Patienter med erhvervet neutropeni og primære immundefekter, der påvirker neutrofile tal og / eller funktion udvikle livstruende invasive bakterie-og svampeinfektioner, fremhæver betydningen af disse celler i værtsforsvar 1.. Immungenkendelse af invaderende patogener på infektionsstedet ved deres beslægtede mønstergenkendelse receptorer resulterer i induktionen af en organiseret medfødt immunrespons, som fører til sekretion af kemoattraktanter, der genererer en kemotaktisk gradient kan rekruttere neutrofiler fra blodbanen ind i det betændte væv 2 . Efter neutrofiler ind i infektionsstedet, de bliver aktiveret, hvilket fører til cytokinproduktion og chemokin produktion, patogen optagelse og drab via oxidativ og ikke-oxidative migchanisms 3.. Udover deres velkendt rolle i medfødte immunitet, har neutrofile også for nylig blevet vist at spille vigtige roller som initiativtagere på effektive adaptive immunrespons 4.. På den anden side, bortset fra deres beskyttende roller i immunitet neutrofile også medierer vævsskade og immunopatologi grund af overdreven ophobning og / eller aktivering ved steder med inflammation, som vist i en række smitsomme sygdomme og autoimmunsygdomme 5-7.
På trods af den uundværlige rolle neutrofiler i montering effektive medfødte immunrespons og deres pleiotropiske effektor funktioner i flere infektionssygdomme og betændelsestilstande tekniske vanskeligheder med håndtering af disse celler og mangel på pålidelige forsøgsprotokoller har hindret forskning neutrofiler over de seneste årtier. Derfor bør brug af reproducerbare assays til isolering af neutrofiler fremme yderligere forskning i neutrofil-medieret immunologiske funktioner ex vivo og in vivo. Til dato har adskillige fremgangsmåder blevet beskrevet til isolering af neutrofiler, såsom densitetsgradientcentrifugering af humant blod og mus blod eller knoglemarv 8,9, positiv eller negativ immunomagnetisk berigelse af neutrofiler fra mus blod eller knoglemarv 10,11, og høst af neutrofiler fra bughulen af mus efter intraperitoneal injektion af Thioglycollat eller andre inflammatoriske midler 12.. Selvom neutrofiler kan let isoleres i store mængder fra humant blod, denne metode er ikke optimal i mus på grund af den begrænsede mængde af museblod der udelukker isolering af tilstrækkelige neutrofiler til funktionelle undersøgelser eller adoptiv overføring eksperimenter 13.. Desuden celler fra bughulen selvom udbyttet af Thioglycollat-fremkaldte er større sammenlignet med mus blod, renheden af neutrofiler i inflammatoriske peritoneumudskylning varierer mellem60-90%, og de isolerede neutrofiler udviser en aktiveret fænotype. Således opsamles cellerne ved hjælp af denne metode kan kun bruges til at udføre funktionelle studier af aktiverede, men ikke af ustimulerede neutrofiler, som musen bughulen har få neutrofiler ved steady state 12. I stedet knoglemarven er en bekvem reservoir til høst stort antal enten stimulerede eller aktiverede neutrofiler 11,14, som derefter kan bruges til efterfølgende funktionelle undersøgelser såsom fagocytose, drab og degranulation eller til adoptiv overførsel til recipientmus.
Heri beskriver vi en enkel og hurtig (~ 2 hr) protokol, der giver et højt udbytte (~ 6-12 × 10 6 neutrofiler / ikke-inficerede mus, eller op til 30-40 × 10 6 neutrofiler / inficerede mus) ren (80 -95%) neutrofiler med> 95% levedygtighed fra knoglemarven. Denne metode bruger kommercielt tilgængelige Histopaque, som er densitetsgradient celle særskiltration medier bestående af Ficoll og natrium diatrizoat, at adskille neutrofiler fra knoglemarven hos mus. Denne metode giver betydeligt større antal neutrofiler pr mus sammenlignet med blod eller bughulen, kan det bruges til at indsamle neutrofiler fra mus både ved steady state eller efter infektion, og det er lettere at lag i forhold til densitetsgradientcentrifugering metode, der bruger diskontinuert Percoll gradienter bestående af 55% / 65% / 75% Percoll i PBS 9.. Desuden er den tid og de ressourcer, der kræves for at indsamle rene neutrofile faldet betydeligt i forhold til neutrofil isolation hjælp fluorescens-aktiveret celle sortering. Også fordi denne metode ikke indebærer en immunomagnetisk berigelse trin, det er mere omkostningseffektivt, og den undgår eksponering af celler til den magnetiske spalte og antistoffer og derved mindske sandsynligheden for neutrofilaktivering.
Ud over at udføre funktionelle undersøgelser af isolerede neutrophils ex vivo og adoptiv overførsel af celler i recipientmus, denne protokol beskriver også en metode til mærkning af isolerede neutrofiler ved hjælp af forskellige CellTracker farvestoffer. Differential mærkning af neutrofiler fra mus af forskellige genetiske baggrunde kan tilpasses i konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser til sporing af overførte neutrofiler i væv af recipientmus ved anvendelse af flowcytometri, som kan give mekanistisk indsigt om direkte rolle af specifikke gener i handel med neutrofiler fra blodet i mål betændte organer 6..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Isolering af knoglemarvsceller hos mus
- Aflive mus ved anvendelse af institutionens dyrepleje udvalg-godkendte protokol og spray dyret overflade med 70% ethanol.
- Lave et snit i huden i midten maven og fjerne skindet fra den distale del af musen, herunder huden, der dækker de nedre ekstremiteter.
- Skær musklerne fra underekstremiteterne med en saks og omhyggeligt forskubbe acetabulum fra hofteleddet, og samtidig undgå at bryde lårbenshovedet.
- Fjerne de resterende muskler fra lårben og skinneben med en skalpel og saks og adskille låret fra skinnebenet på knæleddet udøve omsorg for ikke at bryde knogleenderne. Placer knogler i en petriskål indeholdende iskold RPMI 1640 1X suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
- Fortsæt til de følgende trin i henhold til en vævskultur hætte. Tage ekstra forholdsregler for at opretholde strenge sterile teknikker til at undgå neutrophil aktivering.
- Skyl hvert ben med 70% ethanol (indenfor en petriskål) efterfulgt af tre efterfølgende vaske i iskoldt sterilt PBS (indenfor petriskåle) at skylle ethanolen fra overfladen af knoglerne.
- Inde i en ren steril petriskål, afbrød epifyser af knoglerne og holde dem til side.
- Brug en 25-gauge nål og en 12 ml sprøjte fyldt med RPMI suppleret med 10% FBS og 2 mM EDTA og skylles knoglemarvsceller fra begge ender af knoglen aksler på en 50 ml skruelåg Falcon-rør udstyret med en 100 um filtrere. For effektivt fjerne alle celler, skrabe den indre overflade af knoglerne ved hjælp af 25-gauge nål.
BEMÆRK: Blanchering af knogler tyder på, at cellerne er blevet tilstrækkeligt skrabet.
BEMÆRK: Brug ca. 10 ml af medier til at skylle et lårben / skinneben par. Tilføjelse EDTA til mediet er vigtigt at undgå sammenklumpning af cellerne.
- Skær knoglen epifyseri små 0,5-1 mm 3 stykker med en skalpel og smadre dem gennem de 100 um filter ved hjælp af bagenden af en 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur pipettespids.
- Centrifugeres ved 1.400 rpm i 7 minutter ved 4 ° C.
- Lysere de røde blodlegemer ved at resuspendere cellepelleten i 20 ml 0,2% NaCl i cirka 20 sekunder, efterfulgt af tilsætning af 20 ml 1,6% NaCl. (Kritisk: Må ikke overstige 20-30 sek hypotonisk lysering at undgå knoglemarv celledød Brugen af hypotonisk NaCl i lyse er anbefales over ACK lyserende puffer fordi sidstnævnte har potentiale til at aktivere neutrofiler.).
- Centrifuger i 7 minutter ved 1.400 rpm ved 4 ° C for at opsamle cellerne.
- Vask cellerne med RPMI 1640 1X suppleret med 10% FBS og 2 mM EDTA og centrifugeres som i trin 1.12.
- Udbyttet af knoglemarvsceller ved hjælp af denne metode er omkring 60-80 millioner om uinficeret 8-12 uger gamle C57BL / 6 mus.
2.. Adskillelse af Neutrofilerved densitetsgradientcentrifugering
- Tæl knoglemarvsceller og resuspender i 1 ml iskold steril PBS.
- Tilsæt 3 ml Histopaque 1119 (vægtfylde, 1,119 g / ml) i en 15 ml konisk rør.
- Overlay 3 ml Histopaque 1077 (vægtfylde, 1,077 g / ml) på 3 ml Histopaque 1119.
BEMÆRK: Histopaque 1119 og Histopaque 1077 bør opvarmes til 18-26 ° C før brug.
Kritisk Trin: Forbered farveforløb umiddelbart før brug som forbereder gradient på forhånd vil resultere i diffusion mellem de to lag og suboptimal neutrofil renhed og nyttiggørelse.
Kritisk Trin: Overlejring Histopaque 1077 end 1119 skal gøres langsomt for at undgå at blande de to densiteter, hvilket vil hinder celle adskillelse ved centrifugering.
- Overlejrer knoglemarven cellesuspensionen oven på Histopaque 1077.
Kritisk Trin: overlAying knoglemarven cellesuspensionen Histopaque 1077 skal gøres langsomt for at undgå at forstyrre grænsefladen mellem cellerne og Histopaque 1077.
BEMÆRK: resuspendering knoglemarvsceller fra en ikke-inficerede mus i 1 ml PBS giver neutrofil renhed på> 90%. Men pooling mange knoglemarv kompromitterer neutrofil renhed, for eksempel resuspendering 300 x 10 6 celler i 3 ml PBS reducerer neutrofil renhed fra> 90% til ~ 80%. Derfor bør efterforskerne udfører pilotforsøg for at identificere den ideelle celletal / volumen forhold til deres specifikke eksperimenter
- Centrifuger i 30 minutter ved 2.000 rpm ved 25 ° C uden bremse.
BEMÆRK: Centrifugering af gradienten ved stuetemperatur er kritisk og afgørende for en effektiv adskillelse af neutrofiler.
- Saml neutrofile på grænsefladen af Histopaque 1119 og Histopaque 1077 lag. Vask de indsamlede neutrofiler to gange med RPMI 1640 1X suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin og centrifugeres ved 1.400 rpm i 7 minutter ved 4 ° C.
- Tæl neutrofile og bestemme deres levedygtighed.
BEMÆRK: Neutrofiler er typisk> 95% levedygtige og> 90% rent som bestemt ved FACS-analyse. Den typiske udbytte af neutrofiler fra knoglemarven (dvs. 2 lårben og skinneben 2 knogler) i en ikke-inficerede 8-12 uger gamle C57BL / 6 mus er ~ 6-12.000.000 celler. Dette antal er væsentligt større, når neutrofiler høstes fra knoglemarv af inficerede dyr. Således blev ~ 30-40 millioner neutrofiler / mus genvundet når Candida-inficerede mus blev anvendt til cellehøst 6..
3.. Mærkning af Neutrophils Brug CellTracker Farvestoffer
- Resuspendere neutrofiler ved 5 x 10 6 celler / ml i PBS forvarmet ved 37 ° C.
- Tilføj et CellTracker farvestof i en endelig concentration af 5 uM.
BEMÆRK: CellTracker Grøn (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein diacetat) og CellTracker Orange (CMTMR (5 - (and-6)-4-Chlormethyl Benzoyl Amino tetramethylrhodamin) blev anvendt i denne protokol til differentielt mærke neutrofiler fra vild type og-gendeficient mus.
BEMÆRK: Forbered en stamopløsning på 10 mM CellTracker Green and CellTracker Orange, portion, og opbevares ved -80 ° C, indtil den dag af forsøget.
- Inkuber neutrofiler med 5 uM af den tilsvarende CellTracker farvestof i 10 min ved 37 ° C i et rystevandbad i mørke.
- Vask cellerne to gange med iskold RPMI 1640 1X suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
BEMÆRK: Effektiv vask af cellerne, efter at mærkning takt med CellTracker farvestof er vigtigt at undgå farvestof krydskontaminering før blanding forskelligt mærkede neutrofile befolkninger for downstream konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser.
4.. Adoptiv overføring af neutrofiler i Mus og Analyse af overførte Neutrophils anvendelse af flowcytometri
- Resuspender neutrofiler i iskoldt PBS i en koncentration på 25 x 10 6 celler / ml og injicere 200 pi af suspensionen i den laterale halevene så 5 x 10 6 neutrofiler overføres pr mus. For konkurrencedygtige genudsættelse neutrofile undersøgelser, bland vildtype-og-gendeficient neutrofiler i forholdet 1:1 og indsprøjte en alt 5 x 10 6 neutrofiler per mus som ovenfor.
BEMÆRK: Mindst op til 10 x 10 6 neutrofiler kan adoptivt overført per mus uden indlysende umiddelbare giftighed for dyrene.
- På forskellige tidspunkter efter adoptiv overførsel (fx 1, 2, 3 eller 4 timer efter overførsel), aflive mus og høst blod og / eller knoglemarv og / eller andre målorgan (r) af interesse.
- Forbered single cellesuspensioner fra disse væv til kvantitativ og kvalitativ analyse af adoptivt overført mærkede neutrofiler hjælp offentliggjort protokoller 6,15.
- Efter levende / døde levedygtighed farvning og Fc blokade label celler med CD45 (klon 30-F11), Ly6G (klon 1A8), og CD11b (klon M1/70) og gate på live CD45 + Ly6G + CD11 + neutrofiler. Neutrofiler i denne port indbefatter native neutrofiler i modtagerens mus samt de adoptivt overførte mærkede neutrofiler, som er FITC + (hvis mærket med CellTracker grøn) eller PE + (hvis mærket med Cell Tracker Orange).
BEMÆRK: Neutrofiler kan spores i blod, knoglemarv og nyre af Candida-inficerede mus i mindst 4 timer efter overførsel.
BEMÆRK: Fastgørelse med 2% paraformaldehyd i PBS ikke påvirker den gennemsnitlige fluorescens intensitet neutrofilerne mærket med CellTracker GrEEN eller CellTracker Orange for mindst 48 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er optimeret til høst af knoglemarvsceller fra mus og den efterfølgende adskillelse af neutrofiler fra disse celler ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af kommercielt tilgængelige Histopaque celleadskillende medier. Neutrofiler isoleres ved anvendelse af denne metode kan anvendes til en række aftagere funktionelle studier ex vivo og til adoptiv transfer eksperimenter i recipientmus.
Den typiske udbytte af indsamling af knoglemarvsceller fra både lårben og skinneben pr uinficeret 8-12 uger gamle C57BL / 6 mus er ~ 60 til 80.000.000 celler med en levedygtighed på ~ 94-98%. Downstream densitetsgradientcentrifugering af disse celler ved hjælp af Histopaque density separation medier giver typisk ~ 6-12.000.000 neutrofiler pr inficerede mus. Neutrofiler er 80-95% rene og> 95% levedygtige, som verificeret ved flowcytometri (figur 1). Selvom det er muligt at samle knoglemarvsceller fra flere dyr før tæthedengradient centrifugering skridt, pooling celler anelse nedsætter renheden af de isolerede neutrofile. For eksempel> 90% rene neutrofiler mens overliggende 60-80.000.000 knoglemarvsceller fra en inficeret mus i 1-3 ml PBS udbytterne celle renheden falder til ~ 80% når ~ 300 millioner knoglemarvsceller samles sammen i 3 ml PBS og overlejret.
Desuden denne protokol beskriver trinene til efterfølgende mærkning af neutrofiler med CellTracker farvestoffer, som giver mulighed for sporing af de adoptivt overførte celler i recipientmus hjælp af flowcytometri. Mærkning af neutrofiler med 5 uM CMFDA eller CMTMR synes ikke at påvirke neutrofil overlevelse som mærkede neutrofiler forbliver> 95% levedygtige (data ikke vist). Mærkede neutrofiler kan spores i forskellige musevæv mindst 4 timer efter adoptiv overføring ved hjælp af flowcytometri ved gating på levende CD45 + Ly6G + CD11b +-celler (figur 2).Brugen af differentierede mærkning farvestoffer i vildtype versus-gendeficient neutrofiler i konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser giver mulighed for vurdering af det direkte rolle i et bestemt gen (f.eks chemoattractant receptor 6) i menneskehandelen af neutrofiler fra blodet ind i en given målorgan.
Figur 1. Repræsentative FACS plot af isolerede neutrofiler fra knoglemarvceller hos en ikke-inficerede C57BL / 6 mus ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering protokol. Det venstre panel viser den oprindelige gating anvendes knoglemarvsceller indsamlet fra grænsefladen af Histopaque 1119 og Histopaque 1077 anvendelse af forward og sidespredning (FSC / SSC). Som vist neutrofiler indsamlet fra grænsefladen er> 90% ren (midterste panel) og> 95% levedygtige (højre panel).
<img alt = "Figur 2" src = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
Figur 2. Repræsentative FACS plot af adoptivt overført CMTMR-mærkede neutrofiler høstet fra blod, knoglemarv og nyrer af en modtager Candida-inficerede C57BL / 6 mus 4 timer efter celleoverførsel. De adoptivt overførte CMTMR-mærkede neutrofiler er PE-positive og kan skelnes fra de indfødte neutrofiler i modtagerlandet musen, som er PE-negative. Bemærk, at ekspression af CD11 er større i neutrofiler høstet fra nyren forhold til neutrofiler høstet fra blod og knoglemarv. Stigningen i CD11 ekspression i nyre neutrofiler er konsistent med tidligere resultater 15 og sandsynligvis afspejler aktivering af cellerne ved indgang i nyren, som er den vigtigste målorgan i musemodel af systemisk candidiasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri præsenterer vi en pålidelig, enkel, hurtig og økonomisk protokol til isolering af store antal neutrofiler fra knoglemarven af mus med høj renhed og levedygtighed under anvendelse af en densitetsgradientcentrifugering tilgang. Når denne protokol udføres korrekt, kan ~ 6-12 × 10 6 neutrofiler udvindes fra en ikke-inficerede mus og så mange som ~ 30-40 × 10 6 neutrofiler kan isoleres fra en mus efter infektion 6. De isolerede neutrofiler er 80-95% rene og> 95% levedygtige.
Knoglemarv er en egnet reservoir til opnåelse mus neutrofiler for downstream funktionelle undersøgelser og adoptiv overføring eksperimenter. Første er det tidligere blevet påvist, at knoglemarv neutrofiler er funktionelt ligner blodneutrofiler i mus som celler fra begge rum udviser lignende oxidativ burst og degranulering 16. For det andet, har mus knoglemarv neutrofiler blevet vist at overleve protrhandlet perioder i kultur, betydeligt længere sammenlignet med mus blodneutrofiler 16. Derfor kunne høst af knoglemarv løbet blodneutrofiler mulighed for større udbytte af celler, når de behandles for funktionelle assays ex vivo. Tredje isolering af neutrofiler fra knoglemarven giver den fordel at inddrive signifikant større antal af neutrofiler, der er tilstrækkelige for downstream adoptiv overføring eksperimenter, både ved steady state og efter infektion. I stedet kan væsentligt færre neutrofile kræves tilbagebetalt fra museblod, selv efter infektion, og ikke mange neutrofile er til stede ved steady state i bughulen. Således er thioglycollat eller andre midler typisk bruges til at fremme rekrutteringen af aktiverede neutrofiler i bughinden denne metode er hæmmet af den variable renheden af neutrofiler i det peritoneale akutte inflammatoriske ekssudat (upubliceret, data ikke vist), og induktion af en aktiveret neutrofil phenotype, der er forskellig fra ustimulerede neutrofiler genvundet fra manipuleret mus.
Adskillige metoder er tilgængelige til isolering af neutrofiler fra knoglemarv fra mus. Disse omfatter (a) densitetsgradientcentrifugering nærmer som det præsenterer vi her, at bruger Histopaque density separation medier, og en lignende metode, der bruger diskontinuert Percoll gradienter 17, (b) positive immunomagnetiske udvælgelse tilgange, hvorunder knoglemarvsceller er mærket med en neutrofil-specifikt antistof, såsom Ly6G, og neutrofiler beriges derefter ved binding af de Ly6G-positive celler på en magnetisk spalte 18, (c) negative udvælgelse immunomagnetiske metoder, hvorunder knoglemarvsceller er mærket med en cocktail af antistoffer, der binder på andre celler end neutrofiler (dvs. CD5 for T-lymfocytter, CD45R/B220 til B-lymfocytter, CD49b/DX5 for NK-celler, CD117 for mastceller og hæmatopoietiske stamceller, F4/80 formakrofager og Ter119 til erytrocytter) 11, og derefter neutrofiler er beriget med eluering som antistof-negative fraktion af celler, der ikke binder den magnetiske spalte, og (d) Fluorescens cellesortering, hvorunder knoglemarvsceller er mærket med antistoffer som binder på neutrofiler og andre celler, og neutrofiler separeres derefter ved hjælp af en fluorescens cellesorterer da de celler, der er positive for neutrofile markører, såsom kombinationen af Ly6G og CD11b.
Selvom både positive immunomagnetiske udvælgelse tilgange og fluorescens cellesortering giver meget høje udbytter og renheder af muse neutrofiler, disse metoder har den ulempe i forhold til vores protokol, mærkemidler binder på overfladen af neutrofiler, der potentielt kan ændre deres funktion. Positive immunomagnetiske udvælgelse tilgange har den yderligere begrænsning, at antistof-mærkede neutrofiler binder på en magnetisk søjle for separation, som også kan påvirke cellefunktion. Fluorescens cellesortering har den yderligere ulempe, at betydeligt længere tid er nødvendig til opsamling af cellerne under anvendelse af en fluorescensaktiveret cellesorterings i et laboratorium kerne facilitet, der kan påvirke overlevelsen af neutrofiler på grund af deres korte halveringstid. Vores metode er sammenlignelig med densitetsgradientcentrifugering metode, der bruger diskontinuerte Percoll-gradienter, men lagdeling to Histopaque density separation medier er teknisk meget mindre udfordrende forhold til layering Percoll gradienter bestående af 55%, 65% og 75% vol / vol i PBS , hvilket ofte resulterer i sammenblanding af de to Percoll grænseflader som følge af de små massefylde forskelle mellem de tre lag. Med hensyn til negative immunomagnetiske udvælgelse tilgange, har de også blevet rapporteret at være pålidelige til isolering af et stort antal funktionelt kompetente neutrofiler med høj renhed og levedygtighed fra knoglemarv fra mus 11
Isolerede neutrofiler anvender den beskrevne densitetsgradientcentrifugering metode kan anvendes til en række aftagere funktionelle undersøgelser ex vivo, såsom fagocytose, drab, kemotaksi, cytokinproduktion, oxidativ burst og degranulering assays under anvendelse offentliggjort protokoller 6.. Derudover kan isolerede neutrofiler væreadoptivt overført til modtagende inficerede mus for at evaluere rollen af neutrofil overførsel på mus overlevelse og virkningerne af overførte neutrofiler på immunologiske korrelater såsom cytokinproduktion på steder med infektion i recipientmus. Med henblik herpå adoptivt Tosello Boari og kolleger overført knoglemarv-afledte neutrofiler i Trypasonoma-inficerede recipientmus, der nedreguleret IFN-γ produktion i inficerede milt og lever og resulterede i forbedret overlevelse i en IL-10 afhængig måde 19.
Desuden evnen til at mærke neutrofiler med CellTracker farvestoffer CMFDA og CMTMR tilsyneladende uden farvestof-induceret fald i cellelevedygtighed giver mulighed for differentielt mærke neutrofiler fra mus af forskellige genetiske baggrunde og spore adoptivt overførte mærkede celler i forskellige mus målorganer hjælp strømning cytometri eller intravital mikroskopi. De CellTracker farvestoffer er bevaret i viable neutrofiler og ikke diffunderer til tilstødende celler. I vores studier bruger vi en koncentration på 5 uM for celle mærkning, og vi er i stand til at spore mærkede neutrofiler i blod, knoglemarv og nyrer af Candida-inficerede recipientmus mindst 4 timer efter at neutrofiltallet transfer 6.. Udover CellTracker Grøn og CellTracker Orange, andre farvestoffer herunder CellTracker Violet, CFSE og Snarf-1 er også blevet anvendt med held til at mærke mus knoglemarv-afledte neutrofiler til adoptiv overførsel eksperimenter 11,19,20. Derudover har CellTracker Green and CellTracker Orange farvestoffer blevet effektivt anvendt i en lignende koncentration af 5 uM til mærkning muse milt-T-celler til adoptiv overførsel og sporing eksperimenter 21.. Evnen til differentielt mærke neutrofiler med forskellige CellTracker farvestoffer tillader designe konkurrencedygtige genudsættelse forsøg, ved hvilke et 1:1 forhold af differentielt mærkede neutrofiler fra mus med forskelligegenetiske baggrunde kan adoptivt overføres til recipientmus med et mål til at bestemme den direkte rolle af specifikke gener i menneskehandelen af neutrofiler fra blodet ind betændte væv. Vi har for nylig rapporteret, at kemokinreceptoren CCR1 medierer handel af neutrofiler fra blodet ind Candida-inficerede nyrer sent i løbet af infektion, hvilket resulterer i overdreven ophobning af neutrofiler i nyren, vævsskade og nedsat overlevelse 6..
Som med enhver protokol, også vores metode har sine begrænsninger. For eksempel, på trods af de førnævnte fordele ved høst neutrofile fra knoglemarv i blodet er der store forskelle mellem neutrofiler opnået fra disse to rum, som afhængig af den efterfølgende forskning anvendelsen af de høstede celler kan have en indvirkning på de eksperimentelle resultater. Konkret blodneutrofiler er modne celler, hvorimod neutrofiler fra knoglemarven consist af tre forskellige delpopulationer, der spænder fra umodne promyelocytter / myelocytter til mindre umodne metamyelocytes / band formularer til modne neutrofile som tidligere beskrevet 22.. Derfor kan forskellen i cellen løbetid på mellem knoglemarv og blodneutrofiler resultere i variation i visse celle funktionelle egenskaber som det tidligere er blevet indberettet for neutrofile respons på fMLF (N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanin), og indtagelse af partikler 23. Hertil kommer, fordi nogen neutrofil manipulation ex vivo kan resultere i celle aktivering og apoptose, forsigtighed er absolut påkrævet ved håndtering af celler under gradient centrifugering. Hertil kommer, fordi CellTracker farvestoffer i koncentrationer større end 5 uM negativt kan påvirke neutrofil overlevelse bør denne mulighed skal testes i pilotforsøg af individuelle undersøgere, afhængigt af den nedstrøms funktionelt assay, der vil blive testet.
Sammenfattende pre visendte en pålidelig og reproducerbar metode, der kan anvendes af alle laboratorier til at indsamle og mærke et stort antal mus neutrofiler fra knoglemarven. Denne fremgangsmåde kan anvendes til en bred vifte af neutrofile funktionelle studier, herunder in vivo adoptiv overføring og tracking eksperimenter ved flowcytometri og intravital mikroskopi. Brugen af dette og andre pålidelige protokoller for mus neutrofil rensning, isolering, mærkning og downstream adoptiv overførsel og sporing undersøgelser bør uddybe vores forståelse af neutrofil fysiologi på det molekylære niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af afdelingen for Intramural Research for National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA.
Alle mus blev fastholdt på et American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care-akkrediteret dyrefacilitet på National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIAID), og har til huse i overensstemmelse med de procedurer, der er skitseret i Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i regi af en protokol godkendt af Animal Care og brug Udvalg NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
