Summary
Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.
Abstract
Nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli efektör hücrelerdir. Bunlar hızla akut inflamasyon bölgelerinde işe ve inflamatuar ortamı bağlı olarak koruyucu veya patojenik etkiler gösterebilir vardır. Bununla birlikte, farklı bulaşıcı hastalıklar ve inflamatuar koşullarda nötrofil 'efektör ve immunopathogenic etkileri aracılık moleküler faktörlerin bağışıklık, ayrıntılı bir anlayış nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen hala kısmen, kısa yarı ömrü, bunların kullanımı ile zorluklar, eksik hücreleri ve alt fonksiyonel çalışmalar ve evlat edinen transferi deneyler için nötrofil yeterli sayıda elde etmek için güvenilir deneysel protokollerin eksikliği. Bu nedenle, basit, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir yöntem gibi fagositoz, öldürme, sitokin üretimi, degranülasyonunun ve ticareti gibi işlevleri değerlendirmek için fare nötrofil yeterli sayıda hasat için son derece arzu edilir. Bu amaçla,yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izole etmek için, herhangi bir laboratuvar olarak adapte edilebilir, tekrarlanabilir yoğunluk gradyan santrifüj tabanlı bir protokol, mevcut. Ayrıca, daha sonra adoptively akım sitometri kullanarak en az 4 saat sonrası transferi için alıcı farelere transfer ve çeşitli dokularda izlenebilir izole nötrofil, etiketlemek için CellTracker boyalar kullanan basit bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı CellTracker boyalarla yabani tip ve gen-eksik fareler nötrofil diferansiyel etiketleme başarılı bir şekilde in vivo olarak hedef dokulara kan nötrofilleri ticareti özel genlerin doğrudan rolünün değerlendirilmesi için rekabet repopulation çalışmaların gerçekleştirilmesi için kullanılabilecektir .
Introduction
Nötrofiller, insanlarda en bol lökositlerdir. Onlar mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olarak doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve hareket temel hücresel bileşenidir. Nötrofil sayısı ve / veya fonksiyonunu etkileyen kazanılmış nötropeni ve primer immün yetmezlikler olan hastalar konak savunma 1 bu hücrelerin önemini vurgulayarak hayatı tehdit eden invazif bakteriyel ve mantar enfeksiyonları, geliştirmek. Iltihaplı doku 2 içine kan dolaşımından işe nötrofil yeteneğine sahip bir kemotaktik degrade oluşturmak chemoattractants salgılanmasına yol açan bir yönetilen doğal immün yanıt, en indüksiyon kendi soydaş desen tanıma reseptörleri sonuçları enfeksiyon yerinde patojenlerin işgalci bağışıklık tanınması . Nötrofiller enfeksiyon sitesine girmek sonra, aktif hale, hangi sitokin ve kemokin üretimi, patojen alımı yol açar ve oksidatif ve non-oksidatif beni ile öldürüyorchanisms 3. Doğuştan gelen bağışıklık onların iyi bilinen rolü yanı sıra, nötrofil yakın zamanda etkili adaptif immün yanıtları 4 başlatanlar gibi önemli rol oynar gösterilmiştir. 5-7 bulaşıcı ve öz bağışıklık hastalıklarının çeşitli 'de gösterildiği gibi, diğer yandan, ayrı bağışıklık kendi koruyucu rolleri, nötrofiller, aynı zamanda, aşırı birikimi ve / veya inflamasyon bölgelerinde aktivasyonuna bağlı doku hasarı ve İmmünopatoloji aracılık edebilir.
Montaj etkili doğal immün yanıtları ve çeşitli enfeksiyon hastalıkları ve inflamatuar durumlar, güvenilir deneysel protokollerin bu hücrelerin ve eksikliği taşıma ile teknik zorluklar içinde pleiotropik efektör fonksiyonları nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen geçmiş yıllarda nötrofil, araştırma engellemiştir. Bu nedenle, nötrofillerin izolasyonu için tekrarlanabilir analizlerin kullanımı ve nötrofil aracılı immunolo için daha fazla araştırma kolaylaştırmalıdırjik fonksiyonları, ex vivo ve in vivo. Bugüne kadar, çeşitli yöntemler, örneğin insan kanı, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye ve fare kan veya kemik iliği 8,9, fare kan veya kemik iliği 10,11 nötrofillerin pozitif veya negatif zenginleştirme immünomanyetik olarak nötrofillerin izolasyonu için anlatıldığı ve hasat edilmiştir tiyoglikolat veya diğer enflamatuar ajanların 12 intraperitoneal enjeksiyonu takiben farelerin periton boşluğundan nötrofillerin. Nötrofiller insan kanından kolayca çok sayıda izole edilebilir, ancak bu yöntem, işlevsel çalışmalar ve adoptif transfer deneyleri 13 için yeterli nötrofil izole edilmesini önleyen fare kan sınırlı bir hacme bağlı olarak farelerde suboptimaldir. Verimi tiyoglikolat-ortaya çıkardı, ancak ek olarak, periton boşluğundan kan hücrelerinin fare ile karşılaştırıldığında daha büyüktür, inflamatuar peritoneal lavaj nötrofillerin saflık arasında değişir% 60-90, ve izole edilen nötrofillerin aktive edilmiş bir fenotip sergiler. Bu yüzden, hücreler, fare peritoneal boşluğuna kararlı durum 12 az sayıda nötrofil olduğu gibi bu yöntem sadece, aktif fonksiyonel çalışmalar yapmak için kullanılmaz, ancak uyarılmamış nötrofil edilebilir kullanılarak toplandı. Bunun yerine, kemik iliği ve daha sonra, fagositoz, öldürme ve degranülasyonu veya alıcı farelere adoptif transfer gibi akım aşağı fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir ya da uyarılmamış ve aktifleştirilmiş nötrofillerin 11,14, çok sayıda hasat edilmesi için uygun bir haznedir.
Bu yazıda, yüksek verim sağlayan basit ve hızlı (~ 2 saat) protokolü, tarif (~ 6-12 × 10 6 nötrofil / bulaşmamış fare veya 30-40 × 10 6 nötrofil / enfekte fare) saf (80 -95%) kemik iliğinden>% 95 canlılığı ile nötrofil. Bu yöntem, yoğunluk gradyanlı hücre ayrı olarak ticari olarak temin edilebilen Histopaque kullanırFicoll ve sodyum diatrizoate oluşan oranı ortam, farelerin kemik iliğinden nötrofil ayırmak için. Bu yöntem, kan ya da periton boşluğu ile karşılaştırıldığında fare başına nötrofil önemli ölçüde daha fazla sayıda verir, bu kararlı durum ya da enfeksiyon sonrası her iki farenin nötrofillerin toplamak için kullanılan ve süreksiz kullanan yoğunluk gradyan santrifüj yönteme göre tabakası daha kolay olabilir % 55 /% 65 / PBS içinde 75% 9 Percoll oluşan Percoll gradient. Buna ek olarak, zaman ve saf nötrofil toplamak için gerekli kaynakları önemli ölçüde Floresan-Aktif Hücre Ayırma kullanarak nötrofil izolasyon göre azalmıştır. Ayrıca, bu yöntem, bir immünomanyetik zenginleştirme aşamasında anlamına gelmez, çünkü daha düşük maliyetli olan ve bu nedenle nötrofil aktivasyonunun olasılığını azaltarak, manyetik kolonu ve antikorlar hücrelerinin maruz kalma önler.
Izole neutroph fonksiyonel çalışmalar performans ek olarakils ex vivo ve alıcı farelere hücrelerinin adoptif transfer, bu protokol, aynı zamanda farklı CellTracker boyalar kullanılarak izole nötrofil etiketlenmesi için bir yöntem açıklanır. Çeşitli genetik kökenden farelerden alınan nötrofil Diferansiyel etiketleme kandan nötrofil ticareti belirli genlerin doğrudan rol mekanik fikir sağlayabilir akım sitometri kullanarak alıcı farelerin dokularında transfer nötrofil izlemek için rekabetçi repopulation çalışmalarda adapte edilebilir hedef iltihaplı organları 6 içine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fare Kemik İliği Hücreleri İzolasyon
- Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanan protokolünü kullanarak fareler Euthanize ve% 70 etanol ile hayvan yüzey sprey.
- Orta karın deri bir kesi yapmak ve alt ekstremite kaplayan deri ve fare distal kısmından cilt kaldırmak.
- Makas kullanarak alt ekstremite kasları kesilmiş ve femur başı kırılma kaçınarak dikkatle, kalça eklemi gelen asetabulum yerinden.
- Bir neşter ve makas kullanılarak femur ve tibia gelen kalan kasları çıkarın ve kemik uçları kırmak değil diz egzersiz bakım de tibia gelen femur ayırın. % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 1X içeren bir Petri kabındaki kemikleri yerleştirin.
- Bir doku kültürü kaputu altında aşağıdaki adımlara devam edin. Neutrophi önlemek için sıkı steril teknikleri korumak için ekstra önlem alınl aktivasyonu.
- Kemik yüzeyinden etanol durulayın buz soğukluğunda steril PBS içinde üç yıkamadan sonra (Petri içinde) ve ardından% 70 etanol (bir Petri kabı içinde) ile her bir kemik durulayın.
- Temiz bir steril Petri kabı içinde, kemiklerin epifizleri kesti ve onları bir kenara saklayın.
- Bir 25-gauge iğne ve RPMI,% 10 FBS ve 2 mM EDTA eklenmiş ile dolu bir 12 cc şırınga kullanarak ve bir 100 mikron ile donatılmış, 50 ml'lik vida üst Falcon tüpüne kemik şaftlann her iki ucunda ikinci kemik iliği hücrelerinin bir hizada filtre. Etkili bir biçimde hücreleri çıkarmak amacıyla, 25-gauge iğne kullanılarak kemik iç yüzeyi raspa.
NOT: kemik haşlama hücreleri yeterince kazınmış olduğunu gösterir.
NOT: femur / tibia çifti temizlemek için medya yaklaşık 10 ml kullanın. Orta EDTA ekleyerek hücrelerin kümeleşmeyi önlemek için gereklidir.
- Kemik epifizleri CutBir neşter ve bir 2.5 ml Eppendorf Combitip Artı Biopur pipet arka uç kullanarak 100 mikron filtre aracılığıyla şut küçük 0.5-1 mm 3 adet.
- 4 ° C, 7 dakika boyunca 1400 rpm'de santrifüj
- Yaklaşık olarak 20 saniye boyunca% 0.2 NaCl, 20 ml hücre pelletini tekrar süspanse ederek, kırmızı kan hücrelerinin lize% 1.6 NaCl, 20 ml ilave edilir. (Kritik: kemik iliği hücre ölümü önlemek için hipotonik lizis 20-30 sn aşmayın ikinci nötrofil aktive potansiyeline sahiptir, çünkü parçalama için hipotonik NaCl kullanımı ACK parçalama tampon üzerinde tavsiye edilir.).
- 4 at 1.400 rpm 7 dakika santrifüj ° C hücreleri toplamak için.
- % 10 FBS ve 2 mM EDTA ile takviye edilmiş RPMI 1640 hücreleri 1X yıkayın ve adım 1.12 olarak santrifüj.
- Bu yöntemi kullanarak, kemik iliği hücrelerinin verimi yaklaşık 60-80.000.000 enfekte 8-12 haftalık C57BL / 6 fare başına verilir.
2. Nötrofiller ayrılmasıyoğunluk dereceli santrifüj yoluyla
- Kemik iliği hücreleri saymak ve buz soğukluğunda steril 1 ml PBS içinde yeniden süspanse.
- 15 ml konik bir tüp içinde Histopaque 1119, 3 ml (yoğunluğu, 1.119 g / ml) eklenir.
- Histopaque 1119, 3 ml üzerinde Histopaque 1077 kaplama 3 ml (yoğunluk 1.077 g / ml).
NOT: Histopaque 1.119 ve Histopaque 1.077 18-26 ısındı olmalıdır ° C kullanmadan önce.
Kritik Adım: hemen önceden degrade iki kat ve optimal nötrofil saflık ve kurtarma arasındaki difüzyon ile sonuçlanır hazırlama gibi kullanmadan önce geçişlerini hazırlayın.
Kritik Adım: Kaplama santrifüj sırasında hücre ayırma engel olan iki yoğunlukları, karıştırma önlemek için yavaş yavaş yapılması 1119 ihtiyaçları üzerinde Histopaque 1.077.
- Histopaque 1077 üstüne kemik iliği hücre süspansiyonu Yerleşimi.
Kritik Adım: Overlhücreler ve Histopaque 1077 arasındaki ara rahatsız etmemek amacıyla yavaşça yapılması gereken Histopaque 1077 ihtiyaçları üzerinde kemik iliği hücre süspansiyonu Aying.
Not: 1 ml PBS enfekte olmamış bir fare kemik iliği hücreleri Resuspending,>% 90 saflıkta nötrofil verir. Bununla birlikte, pek çok kemik iliği örneklerinden havuzu nötrofil saflık uzlaşma, örneğin, 3 ml PBS ~% 80 ile>% 90 saflıkta nötrofil azaltır 300 x 10 6 hücre yeniden süspansiyon haline getirilmesi. Bu nedenle, araştırmacılar kendi özel deneyler için ideal bir hücre sayısı / hacim koşulları tanımlamak için Pilot deneyler yapmalıdır
- 25 2.000 rpm'de 30 dakika ° frensiz C için santrifüj.
NOT: Oda sıcaklığında gradyan santrifüj nötrofil etkin bir şekilde ayrılması için önemli ve gereklidir.
- Histopaque 1119 arayüzü nötrofil toplayın ve 1.077 katmanları Histopaque. RPMI ile iki kere yıkayın toplanan nötrofillerden 1X 1640% 10 FBS ve 4, 7 dakika boyunca 1400 rpm'de% 1 penisilin / streptomisin ve santrifüj ° C ile desteklenmiş
- Nötrofil saymak ve canlılığı belirler.
Not: Nötrofiller, tipik olarak> FACS analizi ile belirlendiği gibi% 95 uygulanabilir ve>% 90 saf. Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare kemik iliğinden nötrofillerin tipik verim (yani 2 femur ve tibia kemikleri 2) ~ 6-12.000.000 hücredir. Nötrofil enfekte hayvanların kemik iliğinden hasat edilir, bu numara büyük ölçüde daha büyüktür. Candida ile enfekte farelerde hücre hasat 6 kullanıldı zaman Bu nedenle, ~, 30-40 milyon nötrofil / fare ele geçmiştir.
3. CellTracker Boyalar kullanarak Nötrofiller etiketlenmesi
- 5. nötrofil süspanse x 10 6 hücre / mL PBS içinde 37 ° C'de önceden ılıtılır
- Son bir concent bir CellTracker boya ekle5 mcM oranı.
Not: CellTracker Yeşil (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein diasetat) ve CellTracker Turuncu (CMTMR (5 - (and-6)-4-klorometil benzoil amino tetramethylrhodamine) için farklı yabani tip ve gen-eksikliği nötrofillerin etiketlemek için bu protokolü kullanılmıştır fareler.
NOT: Deney gününe kadar -80 10 CellTracker Green mM ve CellTracker Portakal, kısım, ve mağaza bir stok solüsyonu ° C hazırlayın.
- Karanlıkta çalkalanan bir su banyosu içerisinde 37 ° C 'de 10 dakika boyunca, karşılık gelen CellTracker boya 5 uM nötrofil inkübe edin.
- % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 hücreleri 1X ile iki kere yıkayın.
NOT: hücrelerin Verimli yıkama CellTracker boya ile etiketleme adım çıkışlar için diferansiyel-etiketli nötrofil nüfus karıştırmadan önce boya çapraz bulaşmayı önlemek için gereklidir sonratream rekabetçi repopulation çalışmaları.
4. Fare ve Akım Sitometri kullanarak Aktarılan Nötrofiller Analizinde nötrofillerin Kabul edilmiş Transfer
- 25 x 10 6 hücre / ml ile 5 x 10 6 nötrofil fare başına aktarılır, böylece, yanal kuyruk damarı içine süspansiyonu 200 ul enjekte edilir bir konsantrasyonda buz gibi soğuk PBS içinde süspanse nötrofil. Rekabetçi repopulation nötrofil çalışmaları için, bir 1:1 oranında yabani tip ve gen-eksikliği nötrofil karıştırmak ve yukarıdaki gibi fare başına 5 x 10 6 nötrofiller toplam enjekte edilir.
NOT: En az en fazla 10 x 10 6 nötrofil adoptively hayvanlara açık hemen toksisite olmadan fare başına devredilebilir.
- Evlatlık transferi (örneğin 1, 2, 3 veya 4 saat sonrası transferi) ardından farklı zamanlarda, fare ve hasat kan euthanize ve / veya ilgi kemik iliği ve / veya diğer hedef organ (lar).
- Si hazırlayınyayınlanan protokolleri 6,15 kullanarak adoptively transfer etiketli nötrofil nicel ve nitel analiz için bu dokulardan ngle hücre süspansiyonları.
- Ölü / canlı canlılığı boyama ve Fc abluka, CD45 (klon 30-F11) ile etiket hücreleri, Ly6G (klon 1A8) ve CD11b'nin (klon M1/70) ve kapı canlı CD45 + Ly6G + CD11b + nötrofiller üzerinde. Ardından Bu kapının Nötrofiller FITC (+ CellTracker Yeşil ile etiketlenmiş) veya PE + (Hücre Takibi Portakal ile etiketlenmiş varsa) olan alıcı fare yerli nötrofiller gibi adoptif transfer etiketli nötrofiller bulunmaktadır.
NOT: Nötrofiller en az 4 saat sonrası transferi için Candida ile enfekte farelerde kan, kemik iliği ve böbrek izlenen olabilir.
Not: PBS içinde% 2 paraformaldehit ile sabitleme olumsuz CellTracker Gr ile etiketlenmiş, nötrofillerin ortalama floresan yoğunluğu etkilemezEn az 48 saat süre ile ya da een CellTracker Turuncu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, farelerden elde edilen kemik iliği hücreleri ve ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma ortamı Histopaque kullanılarak yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla, bu hücrelerin, nötrofillerin sonraki ayırma hasat için optimize edilmiştir. Nötrofiller, bu yöntemi kullanan alt fonksiyonel çalışmalar, ex vivo çeşitli ve alıcı farelerde adoptif transfer deneyleri için de kullanılabilir izole edilmiştir.
Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare başına femur ve tibia hem de kemik iliği hücrelerinin toplama tipik verim ~ 94-98% bir canlılığı ile ~ 60-80.000.000 hücredir. Bu hücrelerin aşağı yoğunluk gradiyenti santrifüj Histopaque yoğunluk ayırma ortam kullanırken genellikle bulaşmamış fare başına ~ 6-12.000.000 nötrofil verir. Nötrofiller 80-95% saf ve>% 95 canlı olarak akım sitometri (Şekil 1) tarafından doğrulanmadı. Bu yoğunluk önce birkaç hayvan Havuzu kemik iliği hücreleri mümkün olsa da,gradyan santrifüj adımı, havuzlama hücreler hafifçe Nötrofiller saflığı azaltır. PBS verim 1-3 ml'lik bir enfekte fare 60-80.000.000 kemik iliği hücreleri kaplanacağı ise>% 90 saf nötrofiller, örneğin, hücre saflık ~ 300,000,000 kemik iliği hücreleri 3 bir araya toplanmış zaman için ~% 80 azalır PBS ve kaplanmış ml.
Buna ek olarak, bu protokol aynı zamanda akım sitometri kullanarak alıcı farelere adoptively transfer hücreleri izlemek için izin verir CellTracker boyalar, ile nötrofil sonraki etiketlemesi için adımları açıklar. Etiketli nötrofil kalır olarak CMFDA veya CMTMR 5 mcM ile nötrofil Etiketleme nötrofil yaşam süresi üzerinde etkisi görünmüyor>% 95 canlı (veriler gösterilmemiştir). Etiketli nötrofiller canlı CD45 üzerinde yolluk tarafından akım sitometri kullanarak evlatlık transferinden sonra en az 4 saat süreyle çeşitli fare dokulara takip edilebilir + Ly6G + CD11b + hücreleri (Şekil 2).Rekabetçi repopulation çalışmalarda yabani tip gen karşı eksikliği nötrofillerde diferansiyel etiketleme Boyaların kullanımı, belirli bir hedef organ içine kan nötrofilleri ticareti belirli bir gen (örneğin, kemoatraktan reseptör 6) doğrudan rolünün değerlendirilmesi için olanak sağlar.
Şekil 1. Yoğunluk gradyan santrifüj protokolü kullanılarak enfekte olmamış bir C57BL / 6 fare kemik iliği hücrelerinden izole nötrofil Örnek FACS çizimi. Sol panel kullanılarak ileri ve Histopaque 1119 ve Histopaque 1077 arayüz toplanan kemik iliği hücreleri için kullanılan başlangıç kapılama gösteriyor yan dağılım (FSC / SSC). Gösterildiği gibi, arabirim toplanan nötrofillerden>% 90 saf (orta panel) ve>% 95 uygulanabilir (sağ panel) vardır.
<img alt = "Şekil 2" src = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
Şekil 2. Temsilcisi FACS arsa adoptively transfer CMTMR-etiketli kan, kemik iliği ve bir alıcı Candida ile enfekte C57BL / 6 fare 4 saat aşağıdaki hücre transferi böbreklerden hasat nötrofil. Adoptively transfer CMTMR-etiketli nötrofil PE-pozitif ve ayırt edilebilir PE-negatif alıcı fare yerli nötrofiller,. CD11b ifade kan ve kemik iliğinden hasat edilen nötrofiller ile karşılaştırıldığında böbrek hasat nötrofillerde büyük olduğuna dikkat edin. Böbrek nötrofillerde CD11b ifade artışı önceki sonuçları 15 ile uyumludur ve muhtemelen sistemik kandidoz fare modelinde ana hedef organı olan böbrek, girişte hücrelerinin aktivasyonu yansıtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu olgu, bir yoğunluk gradyan santrifüj yaklaşım kullanılarak yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izolasyonu için güvenilir, basit, hızlı ve ekonomik bir protokol mevcut. Bu protokol doğru gerçekleştirildiğinde, ~ 6-12 x 10 6 nötrofil enfekte olmamış bir fareden elde edilebilir ve en çok ~ olarak 30-40 x 10 6 nötrofil enfeksiyonu 6 sonra bir fareden izole edilebilir. Izole nötrofil% 80-95 saf ve>% 95 yaşayabilir.
Kemik iliği alt fonksiyonel çalışmalar ve adoptif transfer deneyleri için fare nötrofiller elde etmek için uygun bir haznedir. İlk olarak, bir önceki iki bölümlerinde hücreleri benzer oksidatif patlama ve degranülasyonunu 16 sergilediğinden, kemik iliği nötrofillerin farenin kan nötrofil işlevsel olarak benzer olduğu gösterilmiştir. İkinci olarak, fare kemik iliği nötrofil hayatta protr gösterilmiştirKültür zaman hareket süreleri, önemli ölçüde daha uzun fare kan nötrofillerinin 16 ile karşılaştırıldığında. Bu nedenle, kan nötrofil üzerinde kemik iliği hasat işlevsel testleri ex vivo için işlenmiş hücreleri daha fazla verim için izin verebilir. Kemik iliğinden nötrofil Üçüncü olarak, izolasyon kararlı durum ve enfeksiyon sonrasında alt adoptif transfer deneyleri için yeterli olan, nötrofiller, önemli ölçüde daha fazla sayıda geri kazanılması avantajı sunmaktadır. Bunun yerine, önemli ölçüde daha az nötrofil bile enfeksiyon sonra, fare kan kurtarıldı ve pek nötrofiller periton boşluğuna kararlı durumda mevcut olabilir. Bu nedenle, tiyoglikolat ya da diğer maddeler tipik olarak, periton aktif nötrofillerin teşvik etmek için kullanılır, bu yöntem periton akut inflamatuar eksüda (yayınlanmamış veriler gösterilmemiştir) ve nötrofil aktive phenotyp ve indüksiyon içinde nötrofil değişken saflık tarafından engellenmektedirunmanipulated farenin kurtarıldı uyarılmamış nötrofil farklıdır, ör.
Çeşitli yöntemler farenin kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu için kullanılabilir. Bunlar (a), yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye gibi Histopaque yoğunluklu ayırma ortamı kullanan burada sunulan bir ve süreksiz Percoll gradient 17 kullanan benzer bir yöntem, (b) kemik iliği hücreleri değişik etiketlenmiş olan sırasında pozitif immünomanyetik seçme yaklaşımları ile olduğu gibi yaklaşımlar dahil Bu tür Ly6G ve nötrofiller gibi, nötrofil özgü antikor daha sonra (c) kemik iliği hücrelerinin bir antikor kokteyli ile etiketlenir sırasında negatif seçim immünomanyetik yaklaşımlar, bağlamak manyetik bir sütun 18, Ly6G-pozitif hücrelerinin bağları ile zenginleştirilmiş (T lenfositleri için yani CD5, B lenfositleri için CD45R/B220, NK hücreleri için CD49b/DX5, mast hücreleri ve hematopoetik kök hücreler için CD117, F4/80 için nötrofiller dışındaki hücreler üzerindemakrofajlar ve eritrositler için Ter119) 11, ve daha sonra nötrofiller manyetik sütun bağlanmaz hücrelerinin antikor negatif fraksiyon olarak elüsyon ile zenginleştirilmiş ve (d) Floresans Hücre Ayırma Aktif, bu süre boyunca kemik iliği hücreleri antikorlar ile etiketlenir edilir nötrofillerin ve diğer hücreler, nötrofiller ve o bağlama sonra bu Ly6G ve CD11b'nin kombinasyonu olarak nötrofil belirteçler için pozitif olan hücreler gibi bir floresan Aktif hücre sıralayıcı kullanılarak ayrılır.
Pozitif immünomanyetik seçme yaklaşımları ve Floresans aktive hücre sıralama her ikisi de çok yüksek verim ve fare nötrofil saflık sağlamasına rağmen, bu yöntemler markalama maddeleri potansiyel olarak kendi işlevini değiştirebilir nötrofillerin yüzeyi üzerinde bağlamak bizim protokolüne kıyasla dezavantajı vardır. Pozitif immünomanyetik seçme yaklaşımları antikor etiketli nötrofil s manyetik bir sütun üzerinde bağlayan bir ek sınırlamaAyrıca hücre fonksiyonu etkileyebilir Ayırma,. Floresan Aktive Hücre Ayırma önemli ölçüde daha uzun bir zaman olumsuz yarı ömrü nedeniyle, kısa nötrofil hayatta kalma etkileyebilecek bir laboratuar çekirdek tesisi, bir Floresan Aktif hücre sıralayıcı kullanılarak hücrelerin toplanması için gerekli olan ek bir dezavantajı vardır. Önerilen yöntem, süreksiz Percoll gradient kullanan yoğunluk gradyan santrifüj yöntemi ile kıyaslanabilir, fakat katman iki Histopaque yoğunluklu ayırma ortamı katman% 55,% 65 ve% 75 arasında oluşan Percoll gradient ile karşılaştırıldığında çok daha az teknik olarak zor olduğunu PBS içinde hacim / hacim , ki genellikle üç tabaka arasındaki küçük yoğunluk farklılıkları nedeniyle Percoll arayüzleri karıştırılması ile sonuçlanır. Negatif immünomanyetik seçme yaklaşımları ile ilgili olarak, aynı zamanda 11 farenin kemik iliğinden yüksek saflıkta ve canlılığı, fonksiyonel olarak yetkin nötrofil sayıda izolasyonu için güvenilir olduğu bildirilmiştir
Açıklanan yoğunluk gradyan santrifüj yöntemi kullanılarak izole edilmiştir nötrofiller gibi fagositoz, öldürme, kemotaksis, sitokin üretimi, oksidatif patlama ve yayınlanmış protokoller kullanılarak 6 degranülasyonu tahlilleri gibi alt-fonksiyonel çalışmalar, ex vivo çeşitli için kullanılabilir. Buna ek olarak, izole edilmiş nötrofiller olabiliradoptively nötrofil fare sağkalım üzerine transferi ve bu alıcı farelerde enfeksiyon bölgelerinde sitokin üretimi gibi immünolojik ilgisi üzerine transfer nötrofil etkilerinin rolünü değerlendirmek için alıcı enfekte farelere transfer. Bu amaçla, Tosello Boari ve arkadaşları adoptif Trypasonoma-enfekte alıcı farenin, aşağı-regüle IFN-γ enfekte dalak, karaciğer ve üretim ve bir IL-10 bağımlı bir şekilde 19 artan hayatta kalma ile sonuçlanmıştır. Içine iliği türevli nötrofil kemik aktarılır
Ayrıca, hücre canlılığı belirgin boya bağlı azalma olmadan CellTracker boyalar CMFDA ve CMTMR ile nötrofil etiket yeteneği farklı şekilde çeşitli genetik kökenden fareler nötrofil etiketlemek ve akış kullanarak farklı fare hedef organlarda adoptively transfer etiketli hücreleri izlemek için bir fırsat sağlar sitometri veya intravital mikroskopi. CellTracker boyalar viabl korunurE nötrofil ve komşu hücrelere yaygın değil. Çalışmalarımızda biz hücre etiketleme için 5 mcM bir konsantrasyon kullanımı ve başarılı nötrofil transferi 6 sonra en az 4 saat süreyle kan, kemik iliği ve Candida ile enfekte alıcı farelerin böbreklerde etiketli nötrofil takip edebiliyoruz. CellTracker Yeşil ve CellTracker Menekşe, KAKE ve SNARF-1 de dahil olmak üzere CellTracker Turuncu, diğer boyalar yanısıra evlatlık transferi deneyleri 11,19,20 için etiket fare kemik iliği kaynaklı nötrofil başarıyla kullanılmıştır. Buna ek olarak, CellTracker, Yeşil ve CellTracker Turuncu boyalar etkili bir adoptif transfer için fare dalak T hücrelerinin etiketlenmesi ve deneyler 21 takip etmek için 5 uM benzer bir konsantrasyonda kullanılmıştır. Diferansiyel çeşitli CellTracker boyalarla nötrofil etiket yeteneği olan farelerin farklı şekilde etiketli nötrofil 1:1 oranında farklı rekabet repopulation deneyler tasarlamak için izin verirgenetik arka adoptively iltihaplı dokulara kan nötrofil ticareti belirli genlerin doğrudan rolünü belirlemek amacıyla, alıcı farelere aktarılabilir. Yakın zamanda Candida-enfekte böbrekler içine kan nötrofil kemokin reseptörü CCR1 aracılık ticareti enfeksiyon sırasında geç, hangi böbrek, doku hasarı nötrofil aşırı birikimi neden olduğunu bildirdi ve hayatta kalma 6 azalmıştır.
Herhangi bir protokol ile ilgili olarak, yöntem, aynı zamanda sınırlamalar vardır. Örneğin, kan üzerinde kemik iliğinden nötrofillerin hasat söz konusu avantajları rağmen, hasat hücrelerin alt araştırmalar uygulamaya bağlı olarak deneysel sonuçlar üzerinde bir etkisi olabilir bu iki bölmeleri, elde edilen nötrofil arasında önemli farklılıklar vardır. Spesifik olarak, nötrofiller kan, kemik iliği dezavantajları nötrofillerin ise, olgun hücrelerolgunlaşmamış promiyelosit / myelosit gelen olgun nötrofil daha az olgunlaşmamış metamyelocytes / bant biçimlerine aralığı, daha önce 22 açıklanan üç farklı alt popülasyonlarının ist. Daha önce nötrofil fMLF yanıtları (N-formilmethionil-lösil-fenilalanin) ve partiküllerin 23 yenmesi için bildirilmiştir gibi Dolayısıyla, kemik iliği ve kan nötrofil arasında hücre vadesi arasındaki fark belli bir cep işlevsel özellikleri değişkenlik neden olabilir. Herhangi bir nötrofil manipülasyon ex vivo hücre aktivasyonu ve apoptoz neden olabilir, çünkü gradyan santrifüj sırasında hücrelerin tutarken Ayrıca, dikkatli gereklidir. 5 mcM daha büyük konsantrasyonlarda CellTracker boyalar olumsuz nötrofil hayatta etkileyebilecek Buna ek olarak, bu olasılığı test edilecektir aşağı fonksiyonel tahlil bağlı olarak, bireysel araştırmacılar tarafından Pilot deneylerde test edilmelidir.
Özet olarak, öncedenkemik iliğinden fare nötrofil çok sayıda toplamak ve etiketlemek için herhangi bir laboratuvar tarafından istihdam edilebilir, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem gönderdi. Bu yaklaşım, akış sitometrisi ve intravital mikroskopi ile in vivo adoptif transfer ve izleme deneyler de dahil olmak üzere nötrofil fonksiyonel çalışmalar çeşitli için kullanılabilir. Bu ve fare nötrofil arıtma, izolasyon, etiketleme ve alt evlatlık transferi ve izleme çalışmaları için diğer güvenilir protokollerin kullanımı moleküler düzeyde nötrofil fizyoloji anlayışımızı derinleştirmek gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID), Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH), ABD İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir.
Tüm fareler Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID) de Laboratuar Hayvan Bakımı-akredite hayvan tesisin Akreditasyon için Amerikan Derneği muhafaza ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen usullere uygun olarak muhafaza edildi NIAID ve Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol himayesinde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
