Summary
Мы опишем протокол для выделения и очистки нейтрофилов из костного мозга мыши центрифугированием в градиенте плотности и нейтрофилов мечение с применением CellTracker красителей. Это представляет собой простой, быстрый, воспроизводимые и экономичный способ получения большого количества нейтрофилов для последующих функциональных исследований или экспериментов приемных передачи и отслеживания.
Abstract
Нейтрофилы являются критическими эффекторные клетки врожденной иммунной системы. Они быстро набраны на участках острое воспаление и оказывают защитное или патогенных эффектов в зависимости от воспалительной среде. Тем не менее, несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в иммунитете, детальное понимание молекулярных факторов, которые обеспечивают нейтрофилов и эффекторные immunopathogenic эффектов в различных инфекционных заболеваний и воспалительных заболеваний по-прежнему отсутствует, отчасти потому, что их короткий период полураспада, трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов для получения достаточного количества нейтрофилов ниже по течению функциональных исследований и экспериментов приемных передачи. Таким образом, простой, быстрый, экономичный и надежный методы являются очень желательными для сбора достаточного количества нейтрофилов мыши для оценки функции, такие как фагоцитоз, убийства, продукция цитокинов, дегрануляцию и торговли людьми. С этой целью,Мы представляем воспроизводимый центрифугирования в градиенте плотности на основе протокола, который может быть адаптирован в любой лаборатории изолировать большое количество нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой степенью чистоты и жизнеспособности. Кроме того, предложен простой протокол, который использует CellTracker красителей для обозначения изолированных нейтрофилов, которые затем могут быть адаптивно переносили в мышей-реципиентов и отслеживаться в некоторых тканях, по крайней мере, 4 ч после передачи с использованием проточной цитометрии. Используя этот подход, дифференциальные маркировки нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышей с различными красителями CellTracker может быть успешно использован для выполнения конкурентоспособных исследований репопуляцию для оценки непосредственную роль определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в ткани-мишени в естественных условиях .
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов у людей. Они являются основным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и выступают в качестве первой линии защиты от вторжения микроорганизмов. Пациенты с приобретенными нейтропения и первичных иммунодефицитов, которые влияют нейтрофилов номера и / или функции развиваются угрожающие жизни инвазивных бактериальных и грибковых инфекций, подчеркнув важность этих клеток в иммунной защиты 1. Иммунный признание вторжения патогенных микроорганизмов на инфекцию сайта, их родственными распознавания рецепторами приводит к индукции организованной врожденный иммунный ответ, что приводит к секреции хемоаттрактанты которые генерируют градиента хемотаксических способны вербовку нейтрофилов из крови в воспаленную ткань 2 . После нейтрофилов ввести инфекцию сайт, они активизируются, что приводит к цитокинов и хемокинов, патоген поглощение, и убивают через окислительную и неокислительный меняchanisms 3. Кроме того, их хорошо узнаваемая роль во врожденном иммунитете, нейтрофилы также недавно было показано, играют важную роль в качестве инициаторов эффективной адаптивного иммунного ответа 4. С другой стороны, помимо их роли в защитный иммунитет, нейтрофилы могут также посредником повреждение тканей и иммунопатологии из-за чрезмерного накопления и / или активации на участках воспаления, как показано в различных инфекционных и аутоиммунных заболеваний 5-7.
Несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в монтаже эффективной врожденного иммунного ответа и их плейотропную эффекторных функций многих инфекционных заболеваний и воспалительных состояний, технические трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов препятствовал исследование с нейтрофилов в течение последних десятилетий. Таким образом, использование воспроизводимых анализов для выделения нейтрофилов должно облегчить дальнейшее исследование нейтрофилов-опосредованного immunoloческие функции бывших естественных условиях и в естественных условиях. На сегодняшний день несколько методов были описаны для выделения нейтрофилов, такие как центрифугирование в градиенте плотности крови человека и мыши крови или костного мозга 8,9, положительный или отрицательный иммуномагнитного обогащение нейтрофилов из крови мыши или костного мозга 10,11, и сбор нейтрофилов из брюшной полости мышей после внутрибрюшинной инъекции тиогликолята или других противовоспалительных агентов 12. Хотя нейтрофилов может быть легко выделено в больших количествах из крови человека, этот метод является оптимальным у мышей из-за ограниченного объема крови мышей, что исключает выделение достаточного нейтрофилов для функциональных исследований или приемные экспериментов передачи 13. Кроме того, хотя выход тиогликолята-вызывали клетки из брюшной полости больше по сравнению с крови мышей, чистота нейтрофилов в воспалительном перитонеального лаважа изменяется между60-90%, а изолированный нейтрофилы проявляют активированный фенотип. Таким образом, клетки собирали с использованием этого метода может быть использован только для выполнения функциональных исследований активированных но не стимулированных нейтрофилов, как мышь брюшную полость имеет несколько нейтрофилов в стационарном состоянии 12. Вместо этого, костный мозг является удобным резервуар для сбора большого количества или стимулированных или активированный 11,14 нейтрофилы, которые затем могут быть использованы для последующих функциональных исследований, таких как фагоцитоз, убийства и дегрануляции или для приемных передачи в получатель мышей.
Здесь мы описываем простой и быстрый (~ 2 ч) протокол, который обеспечивает высокий выход (~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов / неинфицированных мышей, или до 30-40 × 10 6 нейтрофилов / инфицированные мыши) чистого (80 -95%) нейтрофилов> 95% жизнеспособность из костного мозга. Этот метод использует коммерчески доступные Histopaque, которые в градиенте плотности ячейки отдельнорацион сред, состоящих из Ficoll и натрий диатризоат, отделить нейтрофилов из костного мозга мышей. Этот метод дает значительно большее количество нейтрофилов на мышь по сравнению с полостью крови или перитонеального, он может быть использован для сбора нейтрофилов у мышей и в стационарном состоянии или после инфекции и легче слое по сравнению с центрифугирование в градиенте плотности метод, который использует прерывистый перколлом градиенты, состоящий из 55% / 65% / 75% Percoll в PBS 9. Кроме того, время и ресурсы, необходимые для сбора чистой нейтрофилов значительно снизился по сравнению с выделения нейтрофилов с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток. Кроме того, поскольку этот способ не включать иммуномагнитного шаг обогащения, это более экономически эффективным, и это позволяет избежать воздействия на клетки магнитного колонку и антитела, таким образом уменьшая вероятность активации нейтрофилов.
В дополнение к выполнению функциональных исследований изолированной neutrophшек исключая виво и приемных передачи клеток в мышей-реципиентов, этот протокол также описывает способ маркировки изолированных нейтрофилов с использованием различных красителей CellTracker. Дифференциальный маркировки нейтрофилов у мышей различных генетических фоны могут быть адаптированы в конкурентных исследований репопуляцию для отслеживания переданных нейтрофилов в тканях мышей-реципиентов с использованием проточной цитометрии, которые могут обеспечить механистической представление о непосредственной роли определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в целевые воспаленных органов 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение клеток костного мозга мыши
- Усыпить мышей с использованием уход за животными учреждения Комитета, утвержденных протоколом и распылить животного поверхность с 70% этанола.
- Сделайте надрез кожи в середине живота и удалить кожу от дистальной части мыши в том числе кожного покрова нижних конечностей.
- Отрежьте от мышц нижних конечностей с помощью ножниц и тщательно вывихнуть вертлужной впадины от тазобедренного сустава, в то время как избежать нарушения бедренной кости головы.
- Удалите оставшиеся мышцы бедра и голени с помощью скальпеля и ножниц и отделите от бедренной кости голени в коленном суставе работы следите, чтобы не нарушить концами кости. Поместите кости в чашку Петри, содержащую ледяную RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.
- Переходим к следующему шагу под капот культуры ткани. Принять дополнительные меры предосторожности для поддержания строгих стерильных методов, чтобы избежать neutrophiL активации.
- Промыть каждую кость с 70% этанола (в чашке Петри), а затем трех последующих промывок в ледяной стерильной PBS (в чашках Петри), чтобы смыть этанола с поверхности костей.
- Внутри чистые стерильные чашки Петри, отрезать эпифизов костей и держать их в сторону.
- Использование игла 25-и 12 мл шприц с RPMI с добавлением 10% FBS и 2 мМ ЭДТА, и промыть клетки костного мозга с обоих концов кости валов на 50 мл с завинчивающейся крышкой трубки сокола оснащена 100 мкм процедить. Для того чтобы эффективно удалить все клетки, очистить внутреннюю поверхность кости использованием 25-иглы.
Примечание: Бланширование костей показывает, что клетки были достаточно соскабливают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте примерно 10 мл среды для промывки бедра / голени пары. Добавление ЭДТА в среду важно предотвратить слипание клеток.
- Разрежьте эпифизов костейв небольших 0,5-1 мм 3 шт с помощью скальпеля и разбить их через 100 мкм фильтр, используя заднюю часть 2,5 мл Eppendorf Combitip Plus Biopur пипетки.
- Центрифуга при 1400 оборотов в минуту в течение 7 минут при 4 ° C.
- Лизируйте эритроцитов путем ресуспендирования осадка клеток в 20 мл 0,2% NaCl в течение приблизительно 20 сек с последующим добавлением 20 мл 1,6% NaCl. (Критический: не превышает 20-30 сек гипотонического лизиса, чтобы избежать клеток костного мозга смерти использование гипотонических NaCl для лизиса рекомендуется вместо ACK буфера лизирующие поскольку последний имеет потенциал, чтобы активировать нейтрофилы.).
- Центрифуга в течение 7 минут при 1400 оборотов в минуту при 4 ° С дл сбора клеток.
- Мытье клеток RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 2 мМ ЭДТА и центрифугируют, как в пункте 1.12.
- Выход клеток костного мозга с помощью этого метода составляет примерно 60-80 млн. долл. США в неинфицированных 8-12 недельных C57BL / 6 мыши.
2. Разделение нейтрофилыцентрифугированием в градиенте плотности
- Граф клеток костного мозга и ресуспендируют в 1 мл ледяной стерильной PBS.
- Добавьте 3 мл Histopaque 1119 (плотность 1,119 г / мл) в 15 мл коническую трубку.
- Наложение 3 мл Histopaque 1077 (плотность 1,077 г / мл) в 3 мл Histopaque 1119.
Примечание: Histopaque 1119 и 1077 Histopaque следует нагревают до 18-26 ° С перед использованием.
Важнейший шаг: Подготовка градиенты непосредственно перед использованием в качестве подготовки градиент заранее приведет к диффузии между двумя слоями и субоптимальные нейтрофилов чистотой и выходом.
Важнейший шаг: Наложение Histopaque 1077 по 1119 должно быть сделано медленно, чтобы избежать смешивания двух плотностей, которая исключает разделения клеток во время центрифугирования.
- Перекрытие клетки костного мозга подвески на верхней части Histopaque 1077.
Важнейший шаг: OverlАйинг клетки костного мозга надстройка над Histopaque 1077 должно быть сделано медленно, чтобы не потревожить интерфейс между клетками и Histopaque 1077.
Примечание: ресуспендирования клеток костного мозга от неинфицированных мышей в 1 мл PBS дает нейтрофилов чистоту> 90%. Однако объединение многие образцы костного мозга компрометирует нейтрофилов чистоты, например, суспендированием 300 × 10 6 клеток в 3 мл PBS нейтрофилов снижает чистоту от> 90% до ~ 80%. Таким образом, следователи должны выполнить пилотные эксперименты для определения идеального клеток / объем условия для их конкретных экспериментов
- Центрифуга течение 30 минут при 2000 оборотов в минуту при 25 ° С без тормоза.
Примечание: центрифугирование градиента при комнатной температуре является критическим и необходимы для эффективного разделения нейтрофилов.
- Собирают нейтрофилов на границе Histopaque 1119 и 1077 Histopaque слоев. Промыть собранных нейтрофилов дважды средой RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина и центрифуге при 1400 оборотов в минуту в течение 7 минут при 4 ° C.
- Подсчитайте нейтрофилов и определения их жизнеспособности.
Примечание: Нейтрофилы обычно> 95% жизнеспособных и> 90% чистоты, как определено с помощью анализа FACS. Типичный выход нейтрофилов из костного мозга (например, 2 бедра и голени 2 костей) из неинфицированных 8-12 недельной мыши C57BL / 6 составляет ~ 6-12 миллионов клеток. Это число существенно больше, когда нейтрофилы собирают из костного мозга зараженных животных. Следовательно, ~ 30-40 миллионов нейтрофилов / мышь были восстановлены, когда Candida-инфицированных мышей использовали для сбора клеток 6.
3. Маркировка нейтрофилы Использование CellTracker Красители
- Ресуспендируйте нейтрофилов в 5 х 10 6 клеток / мл в PBS, предварительно нагретой при 37 ° С.
- Добавить CellTracker красителя в конечной концентрациирацион 5 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: CellTracker Зеленый (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Диацетат) и CellTracker Оранжевый (CMTMR (5 - (а-6)-4-амино Chloromethyl бензоила тетраметилродамина) была использована в данном протоколе к дифференциально маркировать нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда Подготовка исходного раствора 10 мМ CellTracker зеленый и оранжевый CellTracker, аликвоты и хранят при температуре -80 ° C до дня эксперимента.
- Инкубируют нейтрофилов с 5 мкМ соответствующего красителя CellTracker течение 10 мин при 37 ° С при встряхивании на водяной бане в темноте.
- Мытье клетки дважды с ледяной RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная промывка клеток после маркировки шаг с CellTracker красителя необходимо, чтобы избежать красителя перекрестного загрязнения перед смешиванием дифференциально меченных популяции нейтрофилов для паденияTream конкурентоспособных исследований заселение.
4. Приемные Передача нейтрофилов у мышей и анализа передаваемой нейтрофилов с использованием проточной цитометрии
- Ресуспендируют нейтрофилов в охлажденном льдом PBS при концентрации 25 × 10 6 клеток / мл и вводят 200 мкл суспензии в латеральную хвостовую вену так, что 5 × 10 6 нейтрофилов передаются на мышь. Конкурентные исследования нейтрофилов заселение, смешивать дикого типа и ген-дефицитных нейтрофилов в соотношении 1:1 и вводят в общей сложности 5 × 10 6 нейтрофилов на мышь, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, до 10 х 10 6 нейтрофилов может быть восприимчиво переданы на мышь без явного немедленного Токсичность по отношению к животным.
- В разное время после приемных передачи (например, 1, 2, 3 или 4 часа после передачи), усыпить мышей и урожай крови и / или костного мозга и / или другие органы-мишени (ы) интересов.
- Подготовьте сиngle клеточные суспензии из этих тканей для количественного и качественного анализа восприимчиво переданы помечены нейтрофилов с использованием опубликованных протоколов 6,15.
- После живой / мертвый окрашивания жизнеспособность и блокады Fc, этикетки клеток с CD45 (клон 30-F11), Ly6G (клон 1A8) и CD11b (клон М1/70) и ворота на живых CD45 + Ly6G CD11b + + нейтрофилов. Нейтрофилы в этом затвор включает родной нейтрофилов получателем мыши, а также восприимчиво переданы помечены нейтрофилы, которые FITC + (если помечены CellTracker зеленый) или PE + (если помечены сотовых Отслеживание оранжевый).
Примечание: Нейтрофилы могут быть отслежены в крови, костного мозга и почек Candida-инфицированных мышей в течение 4 ч после перевода.
Примечание: Фиксация 2% параформальдегидом в PBS, не оказывает отрицательного влияния средней интенсивности флуоресценции нейтрофилов помечен CellTracker Grееп или CellTracker оранжевой течение как минимум 48 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол оптимизирован для сбора клеток костного мозга у мышей и последующее разделение нейтрофилов из этих клеток центрифугированием в градиенте плотности с использованием коммерчески доступных Histopaque раздела сред клетки. Нейтрофилы выделяли, используя этот метод может быть использован для различных функциональных вниз по течению естественных бывший исследований и экспериментов для приемных передачи в получатель мышей.
Типичный выход сбора клеток костного мозга из бедренной кости, как и голени в неинфицированных 8-12 недельной мыши C57BL / 6 составляет ~ 60-80 миллионов клеток с жизнеспособность ~ 94-98%. Переработка центрифугирования в градиенте плотности этих клеток с использованием Histopaque раздела сред плотностью обычно дает ~ 6-12 млн. нейтрофилов в неинфицированных мышей. Нейтрофилы 80-95% чистого и> 95% жизнеспособных, и это будет проверено с помощью проточной цитометрии (рис. 1). Хотя можно объединить клетки костного мозга из нескольких животных, прежде чем плотностьцентрифугирование в градиенте шаг, объединение клетки слегка уменьшает чистота выделенных нейтрофилов. Например, при наложении 60-80 миллионов клеток костного мозга от одного неинфицированных мышей в 1-3 мл PBS выходом> 90% чистоты нейтрофилы, клетки чистоты уменьшается до ~ 80% при ~ 300 млн клетки костного мозга объединяются в три мл PBS и обложил.
Кроме того, этот протокол также описывает шаги для последующей маркировки нейтрофилов с CellTracker красителей, что позволяет отслеживать восприимчиво переданы клетки в мышей-реципиентов с использованием проточной цитометрии. Маркировка нейтрофилов с 5 мкМ CMFDA или CMTMR-видимому, не влияют на выживание нейтрофилов в соответствии с маркировкой нейтрофилы остаются> 95% жизнеспособных (данные не показаны). Маркированный нейтрофилов могут быть отслежены в различные ткани мыши по крайней мере 4 часа после приемных передачи с использованием проточной цитометрии по стробирования на живых CD45 + + Ly6G CD11b + клеток (рис. 2).Использование дифференциального маркировки красителей в дикого типа по сравнению с геном-дефицитных нейтрофилов в конкурентных исследований заселение обеспечивает оценку непосредственную роль конкретного гена (например, хемоаттрактантных рецептор 6) в торговле нейтрофилов из крови в данный орган-мишень.
Рисунок 1. Представитель FACS участок изолированных нейтрофилов из костного мозга клетки неинфицированных C57BL / 6 мыши с помощью центрифугирования в градиенте плотности протокола. Левая панель показывает начальное стробирования используются для клеток костного мозга собраны из интерфейса Histopaque 1119 и 1077 Histopaque использованием форвардных и бокового рассеяния (FSC / SSC). Как показано, нейтрофилы собранных из интерфейса> 90% чистоты (средняя панель) и> 95% жизнеспособных (правая панель).
<IMG Alt = "Рисунок 2" SRC = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
Рисунок 2. Представитель FACS участок восприимчиво переданы CMTMR меченных нейтрофилов собирают из крови, костного мозга и почек получателя Candida-инфицированные мыши C57BL / 6 4 ч после перевода клетки. Восприимчиво переданы CMTMR меченных нейтрофилы PE-положительным и может быть дифференцирована от родной нейтрофилов получателя мыши, которые являются PE-отрицательными. Следует отметить, что выражение CD11b больше в нейтрофилах собирают из почек по сравнению с нейтрофилами собирают из крови и костного мозга. Увеличение CD11b экспрессии в почках нейтрофилов согласуется с предыдущими результатами 15 и, вероятно, отражает активацию клеток после вступления в почках, который является основным органом-мишенью в мышиной модели системного кандидоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы приводим надежный, простой, быстрый и экономичный протокол для выделения большого количества нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой чистотой и выживаемость с помощью центрифугирования в градиенте плотности подхода. Когда этот протокол выполняется правильно, ~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов может быть извлечен из неинфицированных мыши и целых ~ 30-40 × 10 6 нейтрофилов может быть выделен из мышей после заражения 6. Выделенную нейтрофилы 80-95% чистого и> 95% жизнеспособность.
Костный мозг представляет собой подходящий резервуар для получения нейтрофилов мыши для последующих функциональных исследований и экспериментов приемных передачи. Во-первых, она Ранее было показано, что нейтрофилы костного мозга функционально аналогичные нейтрофилов крови у мышей, как клетки из обоих отсеках имеют сходные окислительного и дегрануляции 16. Во-вторых, мышь нейтрофилами костного мозга было показано выжить protrдействовал периодов времени в культуре, значительно дольше по сравнению с мышью нейтрофилов крови 16. Таким образом, сбор костного мозга более нейтрофилов крови делает возможным больший выход клеток при обработке для функциональной естественных условиях бывшего анализов. В-третьих, изоляция нейтрофилов из костного мозга имеет то преимущество, восстановление значительно большего числа нейтрофилов, которые достаточны для последующих экспериментов приемных передачи, и в стационарном состоянии и после заражения. Вместо этого, значительно меньше нейтрофилов может быть извлечен из крови мышей, даже после инфекции, и не так много нейтрофилов присутствуют в стабильном состоянии в брюшной полости. Таким образом, тиогликолевой или других агентов, которые обычно используются для содействия набор активированных нейтрофилов в брюшине, эта методика затрудняется переменной чистота нейтрофилов в брюшную острого воспалительного экссудата (неопубликованные данные не показаны) и индукция активированных нейтрофилов phenotypе, которая отличается от стимулированных нейтрофилов извлечены из unmanipulated мышей.
Существует несколько способов выделения нейтрофилов из костного мозга мышей. Они включают в себя (а) центрифугирование в градиенте плотности подходы, такие как одна, представленные здесь, который использует Histopaque раздела сред плотности, аналогичной методологии, которая использует прерывистый градиент перколлом 17, (б) положительный иммуномагнитного подходы выбора, в течение которых клетки костного мозга помечены нейтрофилов-специфических антител, таких как Ly6G и нейтрофилы затем обогащенный связывания Ly6G-позитивных клеток на магнитной колонну 18, (в) иммуномагнитной негативной селекции подход, при котором клетки костного мозга, которые помечены со смесью антител, которые связываются на клетках, кроме нейтрофилов (т.е. CD5 на Т-лимфоциты, CD45R/B220 для лимфоцитов, CD49b/DX5 для НК-клеток, CD117 для тучных клеток и гемопоэтических стволовых клеток, F4/80 замакрофагов и Ter119 на эритроциты) 11, а затем нейтрофилов обогащены элюированием как антитело отрицательного фракции клеток, который не связывается на магнитной колонна, и (г) флуоресценции Активированный сортировки клеток, при котором клетки костного мозга, которые помечены с антителами которые связывают на нейтрофилы и другие клетки, нейтрофилы и затем разделены с использованием клеток с возбуждением флуоресценции сортировщик как клетки, которые являются положительными для нейтрофилов маркеров, таких как сочетание Ly6G и CD11b.
Хотя как положительные, так иммуномагнитного подходы отбора и флуоресцентной сортировки клеток обеспечивают очень высокими выходами и чистотой мышь нейтрофилов, эти способы имеют тот недостаток, по сравнению с нашими протокол, что маркировка агенты связываются на поверхности нейтрофилов, которые потенциально могут изменить свои функции. Положительные иммуномагнитного подходы выбор имеют дополнительное ограничение, меченных антител нейтрофилов связывают на магнитной колонке сeparation, что также может повлиять на функции клеток. Флуоресценции Активированный сортировки клеток имеет дополнительный недостаток, что значительно больше времени требуется для сбора клеток с использованием клеток с возбуждением флуоресценции сортировщик в учреждении лаборатории ядра, которые могут негативно влиять на выживаемость нейтрофилов в связи с их коротким периодом полураспада. Наш метод сравним с центрифугирование в градиенте плотности метод, который использует разрывными градиентами Перколла, но наслоение двух Histopaque раздела сред плотность технически гораздо менее сложной по сравнению с наслоением перколлом градиенты, состоящий из 55%, 65% и 75% об / об в PBS , что часто приводит к перемешиванию перколлом интерфейсов из-за небольших различий в плотности между трех слоев. Что касается отрицательного иммуномагнитного подходы отбора, они также сообщили надежной для выделения большого количества функционально компетентных нейтрофилов с высокой чистотой и жизнеспособность из костного мозга мышей 11
Изолированные нейтрофилов с использованием описанного центрифугирования в градиенте плотности метод может быть использован для различных функциональных вниз по течению естественных бывший исследований, таких как фагоцитоз, убийство, хемотаксис, продукции цитокинов окислительного и дегрануляции анализов с использованием опубликованных протоколов 6. Кроме того, изолированных нейтрофилов может бытьвосприимчиво переданы в получатель инфицированных мышей, чтобы оценить роль нейтрофилов передачи на выживание мышей и последствия переданы нейтрофилов на иммунологические корреляты таких как продукция цитокинов в местах инфекции у мышей-реципиентов. С этой целью Tosello Boari и коллеги восприимчиво переданы костного мозга нейтрофилов в Trypasonoma-инфицированных мышей-реципиентов, которые вниз регулируемой IFN-γ производства в инфицированных селезенки и печени и привело к повышению выживаемости IL-10-зависимым образом 19.
Кроме того, способность маркировать нейтрофилов с CellTracker красители CMFDA и CMTMR без видимых краситель индуцированного снижение жизнеспособности клеток дает возможность дифференциально маркировать нейтрофилов у мышей различных генетический фон и отслеживать восприимчиво переданы меченых клеток в разных мышь органы-мишени с использованием проточной цитометрии или прижизненной микроскопии. CellTracker красители удерживаются в viablэлектронной нейтрофилов и не диффундируют к соседним ячейкам. В наших исследованиях мы используем концентрации 5 мкМ для мечения клеток, и мы в состоянии успешно трек обозначен нейтрофилов в крови, костном мозге и почках Candida-инфицированных мышей получателей по крайней мере 4 часа после нейтрофилов передачи 6. Кроме того, зеленый и CellTracker CellTracker Orange, в том числе другие красители CellTracker фиолетовый, CFSE и SNARF-1 также успешно используется для обозначения мыши костного мозга нейтрофилы для приемных эксперименты передачи 11,19,20. Кроме того, зеленый и CellTracker CellTracker оранжевый красители были эффективно использованы в подобной концентрации 5 мкМ для маркировки клеток селезенки мыши T для приемных передачи и отслеживания экспериментов 21. Способность дифференциально маркировать нейтрофилов с различными красителями CellTracker позволяет проектировании конкурентоспособных заселение экспериментов, в которых соотношение 1:1 дифференциально помечены нейтрофилов у мышей с различнымигенетический фон может быть восприимчиво переданы в мышей-реципиентов с целью определить непосредственную роль определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в воспаленные ткани. Мы недавно сообщили, что рецептора хемокина CCR1 опосредует торговли нейтрофилов из крови в Candida-инфицированных почки на поздних стадиях инфекции, что приводит к избыточному накоплению нейтрофилов в почках, повреждение тканей и снижение выживаемости 6.
Как и с любым протоколом, наш метод также имеет свои ограничения. Например, несмотря на вышеперечисленные преимущества уборки нейтрофилов из костного мозга за кровь, имеются заметные различия между нейтрофилы, полученные из этих двух отсеков, которые в зависимости от прикладных исследований вниз по течению из собранных клеток могли бы оказать влияние на результаты эксперимента. В частности, нейтрофилов крови являются зрелыми клетками, в то время как нейтрофилов из костного мозга минусыист трех различных подгрупп населения, которые варьируются от незрелых промиелоциты / миелоцитов до менее незрелых метамиелоциты / группа до зрелых форм нейтрофилов, как описано выше 22. Таким образом, различие в клеточной зрелости между костного мозга и крови нейтрофилов может привести к изменению в определенной соте функциональные характеристики, как сообщалось ранее для нейтрофилов ответов на fMLF (N-формилметионил-лейцил-фенилаланин) и проглатывания частиц 23. Кроме того, поскольку любая нейтрофилов естественных условиях бывшего манипуляция может привести к активации клеток и апоптоз, необходима осторожность при обращении с клетками во время центрифугирования в градиенте. Кроме того, поскольку CellTracker красителей в концентрации более 5 мкм, могут отрицательно влиять на выживание нейтрофилов, эта возможность должна быть проверена в пилотных экспериментах отдельных исследователей, в зависимости от вниз по течению функциональном анализе, которые будут проверены.
Таким образом, мы заранееотправлено надежным и воспроизводимым методом, который может быть использован любой лаборатории для сбора и маркировать большое количество мыши нейтрофилов из костного мозга. Этот подход может быть использован для различных нейтрофилов функциональных исследований, включающих в естественных условиях приемных передачи и отслеживания экспериментов с помощью проточной цитометрии и прижизненной микроскопии. Использование этих и других надежных протоколов для мыши нейтрофилов очистки, изоляции, маркировки и вниз по течению приемных передачи и отслеживания исследования должны углубить наше понимание физиологии нейтрофилов на молекулярном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана отделом очной исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национального института здоровья (NIH), США.
Все Мышей содержали в американской ассоциации по аккредитации лабораторий Animal Care аккредитованных вивария при Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных под эгидой протоколом, утвержденным уходу и использованию животных комитета NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
