Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تعزيز بقاء وتمايز الخلايا الجذعية العصبية مع الليفين وعامل نمو الكوكتيلات بعد إصابة الحبل الشوكي الشديدة

Published: July 27, 2014 doi: 10.3791/50641
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1,2
1Veterans Administration Medical Center, San Diego, 2Department of Neurosciences, University of California, San Diego

Summary

واستخدمت المصفوفات الليفين التي تحتوي على عوامل النمو للاحتفاظ الخلايا الجذعية العصبية المطعمة في مواقع كاملة transection الحبل الشوكي. الخلايا المطعمة شغلها تماما في تجويف الآفة ومتباينة إلى عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية التي امتدت إلى محاور المضيف الحبل الشوكي لمسافات طويلة.

Abstract

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) يمكن تجديد الذات والتمايز إلى خلايا عصبية والدبقية. يمكن NSCs زرع الخلايا العصبية المفقودة واستبدال الدبقية بعد إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، ويمكن أن تشكل التبديلات وظيفية لإعادة الاتصال شرائح الحبل الشوكي فوق وتحت الآفة. تم دراسات سابقة التطعيم الخلايا الجذعية العصبية محدودة بسبب بقاء الكسب غير المشروع غير مكتملة داخل تجويف آفة الحبل الشوكي. علاوة على ذلك، لم تتبع الأمثل للبقاء الخلية الكسب غير المشروع، والتمايز، وتمديد العملية. أخيرا، في الدراسات السابقة، تم الإبلاغ عن NSCs الفئران مثقف عادة على التمايز إلى الدبقية عندما المطعمة إلى الحبل الشوكي المصاب، بدلا من الخلايا العصبية، إلا إذا كان مدفوعا مصير لنوع من الخلايا المحددة. لمعالجة هذه القضايا، وضعنا أساليب جديدة لتحسين البقاء على قيد الحياة، والتكامل وتمايز NSCs لمواقع اصابات النخاع الشوكي حتى شديدة. NSCs تم عزل حديثا من الجنينية يوم 14 الحبل الشوكي (E14) من مستقر المعدلة وراثيا فيشر 344 خط معربا عن الفئران الخضراء فلوريداكانت جزءا لا يتجزأ uorescent البروتين (GFP) وإلى المصفوفة الليفين التي تحتوي على عوامل النمو؛ هذه الصيغة تهدف إلى الإبقاء على الخلايا المطعمة في تجويف الآفة ودعم بقاء الخلية. تم زرع NSCs في الليفين / عامل النمو كوكتيل بعد أسبوعين الصدري مستوى 3 (T3) كاملة transections الحبل الشوكي، وبالتالي تجنب فترات الذروة من الالتهابات. الطعوم الناتجة تملأ تجويف تماما الآفة ومتباينة في كل من الخلايا العصبية، الذي مدد محاور في الحبل الشوكي المضيف لمسافات طويلة بشكل ملحوظ، والدبقية. أدى الطعوم من NSCs الإنسان مثقف التعبير عن GFP في نتائج مماثلة. وبالتالي، يتم تعريف الأساليب لتحسين العصبية ترقيع الخلايا الجذعية والبقاء وتحليل النتائج في الجسم الحي.

Introduction

إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) غالبا ما يضر ليس فقط مساحات بيضاء المسألة التي تحمل إشارات من وإلى الدماغ، ولكن أيضا المادة الرمادية المركزية، مما تسبب في فقدان قطعي من interneurons والخلايا العصبية الحركية. نتيجة لاصابات النخاع الشوكي هو خسارة كل من المحرك وظيفة الحسية تحت الآفة. وللأسف، فإن الكبار الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تتجدد من تلقاء أنفسهم، مما أدى إلى عجز وظيفي دائم 1. وبالتالي، وإعادة بناء النخاع الشوكي المصاب الكبار وتحسين المحركات والحسية وظيفة اللاإرادي هو هدف مهم من البحوث اصابات النخاع الشوكي. الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، سواء كانت معزولة مباشرة من الجنينية أو الكبار CNS، هي خلايا مرشح مقنعة لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة والدبقية. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا لديها القدرة على تشكيل التبديلات وظيفية جديدة لاستعادة التوصيل عبر محور عصبي 2،3 موقع الآفة.

حتى الآن، لم يكن هناك توضيح مفصل لالتشريحية، electrophysiological والآثار السلوكية لتشكيل تتابع الخلايا العصبية عن طريق زرع NSCs بعد اصابات النخاع الشوكي الشديدة. هناك عدة أسباب لذلك: أولا، NSCs زرع الجنين أو الأنسجة CNS البقاء على قيد الحياة سيئة عندما المطعمة في تجاويف آفة كبيرة. تظهر الدراسات السابقة فقدان الخلية في وقت مبكر كبيرة، وترك كبيرة فارغة تجاويف الآفة الكيسي 4،5. في بعض الدراسات الخلايا المطعمة ستقسم في وقت لاحق وملء تجويف آفة 4،5، ولكن هذا قد يحدث بعد تأخير لأيام وأسابيع، واللاحقة موقع الآفة ملء قد لا تكون كاملة أو متسقة. الثاني، وهو نظام تتبع فعال التي توفر بيانات سليمة على البقاء على قيد الحياة الخلوية، والتمايز / النضج، وثمرة من زرع NSCs كان مطلوبا. معظم الدراسات المبكرة استخدمت تقدمي ووضع العلامات إلى الوراء لتتبع توقعات محور عصبي من زرع 2،3. ومع ذلك، هذه التقنيات جزئيا فقط، وغالبا ما وصفت التوقعات محور عصبي غير واضح الناشئة من الخلايا المطعمة، وأساليب التتبع هي subjecر إلى التحف التي يسببها تسرب الصبغة خارج الخلايا المزروعة. استخدمت الجماعات الأخرى علامات العصبية محددة الإنسان لتسمية التوقعات محور عصبي بعد زرع الجنين NSCs الإنسان في القوارض إصابة الحبل الشوكي 5،6. ومع ذلك، في هذه الدراسات، وxenografts لم تنج باستمرار أيضا. في الآونة الأخيرة، تم استخدام التسليم الفيروسية من الجين مراسل GFP لتسمية NSCs مثقف 7،8. ومع ذلك، كان GFP التعبير في كثير من الأحيان غير متناسقة ويمكن أسفل ينظم-7. في الآونة الأخيرة، واستخدام الفئران المعدلة وراثيا المانحة أو الفئران معربا عن ثابت الجين المراسل، GFP، أو الفوسفاتيز القلوي المشيمة البشرية، قد تحسنت بشكل كبير تتبع زرع الخلايا الجذعية العصبية / الأسلاف في الجسم الحي 9،11. الثالثة، العديد من الدراسات تشير إلى أن الفئران في المختبر NSCs مثقف المستمدة إما من الجنينية أو الكبار CNS التفريق حصرا في الأنساب الدبقية عند زرعها في الوسط من مجلس النواب الشوكي الكبار سليمة أو جرحواد 7،12،13، على الرغم من أن هذه الخلايا الجذعية العصبية قادرة على التمييز في كل من الخلايا العصبية والدبقية في المختبر، مشيرا إلى أن البيئات المحلية قد تملي مصير الخلايا الجذعية. بدلا من ذلك، NSCs مثقف، لا سيما تلك المتأتية من الجهاز العصبي المركزي الكبار، قد يكون الجوهرية الملكية بواسطة defaulty على التمايز إلى الأنساب الدبقية في الجسم الحي 13.

بسبب القيود التي نوقشت أعلاه، وضعت مجموعتنا مؤخرا بروتوكول جديد لتحسين الجنينية تتبع مجلس الأمن القومي، وبقاء، وتمايز / نضوج الكبار في الحبل الشوكي بجروح بالغة. لفترة وجيزة، بدأنا مع مستقرة المعدلة وراثيا خط فيشر 344 الفئران inbreed تعبر عن الجين مراسل GFP أن يديم GFP التعبير بعد زرع في الجسم الحي 14. المقبل، استخدمنا NSCs معزولة حديثا من يوم الجنينية 14 فيشر 344 الحبل الشوكي، ومرحلة التنمية التي يحتفظ القدرة على توليد كل من الخلايا العصبية والدبقية. أخيرا، ونحن جزءا لا يتجزأ منNSCs فصلها حديثا في مصفوفة الليفين التي تحتوي على عوامل النمو 15-17 الإبقاء على الخلايا وتوزيعها بالتساوي داخل تجويف آفة كبيرة، وتهدف لدعم بقاء الخلية الكسب غير المشروع، والتمايز والتكامل. وضعت الطعوم في مواقع T3 transection كاملة، بعد أسبوعين من اصابة في الحبل الشوكي. هذه الخلايا المطعمة شغل باستمرار مواقع transection كاملة ومتباينة في الخلايا العصبية وفيرة التي امتدت أعداد كبيرة من محاور عصبية في الحبل الشوكي المضيف لمسافات طويلة 18. وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام الطعوم مثقف الخلايا الجذعية العصبية البشرية لنقص المناعة الفئران 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية VA-سان دييغو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC). اتباع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لمختبر الرعاية الحيوانية وسلامة تامة. الحيوانات لديها حرية الوصول إلى الغذاء والماء طوال فترة الدراسة ويتم التعامل على نحو كاف لتقليل الألم والانزعاج.

1. إعداد الليفين مكونات تحتوي على عامل نمو كوكتيل

  1. حل 25 ملغ الفئران الفيبرينوجين في 0.5 مل PBS الحصول على 50 ملغ / مل 2X محلول المخزون (انظر الجدول مواد). الفيبرينوجين من الصعب حل وينبغي أن توضع في الحاضنة 37 درجة مئوية أو بالحمام المائي واهتزت كل 5-10 دقيقة لمدة 1-2 ساعة.
  2. حل 100 الثرومبين الفئران للامم المتحدة في 2 مل من 10 ملي العقيمة و CaCl 2 للحصول على 50 U / مل 2X محلول المخزون.
  3. حل عوامل النمو في برنامج تلفزيوني في تركيزات التالية للحصول على حل 100 ميكرولتر الأسهم: 1 ملغ / مل: عامل التغذية العصبية؛ NT-3 (تركيز الأسهم المرتفعة كما التسريب داخل القراب في الجسم الحي
  4. حل 25 ملغ MDL28170 (calpain المانع) في 1.3 مل DMSO للحصول على 50 ملي حل DMSO الأوراق المالية، ومن ثم تمييع 50X في برنامج تلفزيوني للحصول على 1 ملي محلول المخزون.
  5. مزيج 100 ميكرولتر من كل مكون عامل النمو و 100 ميكرولتر من MDL28170 (1 ملي حل الأسهم) لإنتاج 1،000 ميكرولتر عامل النمو كوكتيل الحل (الشكل 1).
  6. مزيج 500 ميكرولتر حل الأسهم 2X الفيبرينوجين مع 500 ميكرولتر عامل النمو كوكتيل للحصول على حل 25 ملغ / مل العمل الفيبرينوجين تحتوي على عوامل النمو وقسامة في 10 أو 20 ميكرولتر للتخزين في -70 درجة مئوية. الحل هو مستقر لمدة تصل إلى 12 شهرا في -70 درجة مئوية.
  7. وبالمثل، مزيج 500 ميكرولتر الثرومبين الحل 2X مع 500 ميكرولتر الأسهم عامل النمو كوكتيل للحصول على 25 U / مل حل الثرومبين عمل تتضمن عوامل النمو وقسامة في أحجام مماثلة 10 أو 20 ميكرولتر لتخزين ور -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
  8. في يوم التطعيم، ضع الكوكتيلات الفيبرينوجين وعامل النمو التي تحتوي على الثرومبين على الجليد حتى تمتزج مع الخلايا.

2. T3 العمود الفقري الحبل Transection

  1. تخدير البالغات فيشر 344 الفئران او الجرذان عارية athymic باستخدام أساليب مقبولة. يتم تخدير المواضيع بعمق، عند الاستجابة للذيل ومخلب قرصة غائبة تماما. ملاحظة: نحن عادة استخدام الفئران 150-200 غرام 180-220 غرام أو فيشر athymic الفئران، وكوكتيل التخدير (2 مل / كغ) من الكيتامين (25 ملغ / مل)، زيلازين (1.3 ملغ / مل) وآسيبرومازين (0.25 ملغ / مل).
  2. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف أو إصابة العينين في حين أن الحيوانات هي تحت التخدير.
  3. حلق منطقة الصدر العلوية وتنظيف البشرة مع بتدين.
  4. قطع الجلد والعضلات باستخدام شفرة رقم 15، فضح T3 فقرة باستخدام ضام الجراحية، وإجراء الثقب في T3 فقرة لفضح T3 / 4 الحبل الشوكي باستخدام مقراض.
  5. جعل خط الطولgitudinal شق خط الوسط في الجافية من حوالي 2 ملم طول باستخدام شفرة رقم 11.
  6. وضع مقص قطع القزحية تحت الجافية لخفض الحق الجانبي الحبل الشوكي بأكمله. جعل خفض آخر على نفس الجانب 1.5 ملم أكثر cadually.
  7. نضح الأنسجة الحبل الشوكي بين قطع اثنين من شرائح حادة مع 23 G إبرة متصلة معتدلة الشدة فراغ. استخدام التحقق البصرية لضمان transection كاملة البطني وأفقيا. وهذا إكمال تنصيف الجانبية.
  8. تمديد الآفة إلى الحبل الشوكي transection كاملة العرض، ووضع مرآة شقوق في hemicord اليسرى. محاولة لمغادرة الجافية سليمة، وغيرها من القطع الأول، الإبقاء على شركة المصفوفة الكسب غير المشروع / الليفين في موقع الآفة عندما المطعمة بعد أسبوعين.
  9. خياطة العضلات، وتطبيق مسحوق المضادات الحيوية والأساسية الجلد.
  10. حقن أفرز اللبن (3 مل) رينغر، Bannamine (2.5-5 ملغ / كلغ) والأمبيسلين (80-100 ملغ / كلغ) (انظر الجدول مواد) فورا بعد الجراحة ومايالفئران ntain في حاضنة دافئة حتى يتم إعادة تأسيس الحراري.
  11. إفراغ المثانة وحقن الحل رينغر والأمبيسلين مرتين في اليوم لمدة أسبوعين تقريبا حتى إقامة المثانة منعكس إفراغ (الشكل 1B).

3. إعداد طازجة تنفصل يوم الجنينية 14 الحبل الشوكي العصبية الخلايا الجذعية

  1. الحصول inbreed المعدلة وراثيا الفئران GFP F344 (F344-تيراغرام (UBC-EGFP) F455Rrrc) من الجرذ الموارد ومركز الأبحاث، جامعة ولاية ميسوري.
  2. حقن 40 ميكروغرام دي الغليسين 10، [مد علاء 6]-Leuteinizing هرمون إفراز هرمون Ethylamide (ال اتش ار اتش) المخفف في برنامج تلفزيوني بتركيز 200 ميكروغرام / مل الغشاء البريتونى (IP) في الفئران الإناث الناضجة (8 أسابيع أو أكثر) بعد 2 ساعة -3 ضوء الاستقراء لتزامن جمع الأجنة.
  3. تتزاوج مع ناضجة GFP متماثلة اللواقح أو متخالف بين عشية وضحاها الفئران الذكور بعد 4 أيام الحقن.
  4. جمع الأجنة في الأيام 13،5-14،5 postcoitus(الكمبيوتر) في المخزن HBSS الباردة، ودراسة GFP التعبير تحت "NightSea" المصباح وتصفية نظارات (BLS1 - بلوستار المصباح ونموذج VG1 مرشح حاجز) أو المجهر الفلورسنت.
  5. تشريح النخاع الشوكي من جو معقم و مطهر من كل الجنين GFP إيجابية وإزالة السحايا المغطي وتعلق العقد الشوكي مع مقص قطع القزحية والمجوهرات غرامة ملقط.
  6. جمع النخاع الشوكي تشريح في 2 العازلة HBSS الباردة مل في أنبوب 15 مل cornical والحفاظ على الجليد.
  7. اتباع المرجعية رقم 20 لفصل النخاع الشوكي تشريح:
    1. لفترة وجيزة، إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين EDTA-إلى أنبوب يحتوي النخاع الشوكي تشريح (عدة الحبال يمكن هضمها معا، يمكن توليد خلايا الحبل 1 بما فيه الكفاية لكسب غير مشروع من موضوع واحد) وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة.
    2. وقف رد الفعل التربسين وذلك بإضافة 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS في أنبوب الطرد المركزي والأنسجة في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
    3. في resuspend الأنسجة في 2 مل المتوسطة Neurobasal المشتركntaining 2٪ B27، ويسحن أنسجة الحبل الشوكي باستخدام أصغر تدريجيا pipets باستور مصقول النار.
    4. الطرد المركزي الخلايا في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة، resuspend في 2 مل من المتوسطة Neurobasal تحتوي على B27، وخلايا التصفية مع 40 ميكرون تصفية خلية مصفاة.
  8. عد الخلايا مع عدادة الكريات وتقسيم الخلايا بالتساوي الى قسمين أنابيب إيبندورف.
  9. الطرد المركزي الخلايا وإزالة طاف (مطلوبة 1-2 دقيقة إلى سحب جميع طاف مع طرف فراغ منخفض) بحيث لن تضعف الكوكتيلات عامل النمو من خلال ما تبقى طاف بعد اعادة تعليق الخلايا.
  10. في resuspend كل شوط من الخلايا في الفيبرينوجين أو حل الثرومبين العمل التي تحتوي على عوامل النمو، على التوالي، في تركيز 250،000 خلية / ميكرولتر (التهم بيليه الخلية لحوالي ⅓ الحجم النهائي) ووضعها على الجليد قبل الزرع (الشكل 1A). نلاحظ أن الفيبرينوجين قد هلام عفويا عند مزجه مع خليةو قبل الجمع مع الثرومبين في موقع الآفة / الكسب غير المشروع؛ لتجنب gellation سابق لأوانه، وخلط الخلايا في الفيبرينوجين على الفور قبل تطعيم خلية في الجسم الحي.

4. زرع

  1. Reexpose في lesioned T3 / 4 الحبل الشوكي بعد أسبوعين transection الحبل الشوكي.
  2. 5 ميكرولتر الفيبرينوجين خلايا و 5 ميكرولتر الثرومبين خلايا يمكن حقنه مباشرة في تسع نقاط من موقع الآفة من خلال مختومة ندبا والجافية سليمة دون إعادة فتح موقع الآفة.
  3. استخدام إبرة G 27 لإنشاء 9 ثقوب على سطح ندبا والجافية سليمة آخر 1-2 أسابيع الآفة: 3 في مركز (واحد في نقطة الوسط واثنان في الخطوط الفرعية، وبصرف النظر متباعدة 0.5 مم) و 3 في كل من منقاري و 3 في واجهة الذيلية (حوالي 0.5 مم منقاري أو الذيلية إلى مركز الآفة).
  4. ثم حقن نصف حجم الخلية الحل الفيبرينوجين إلى ثلاث نقاط مركزية للموقع الآفة وبلغ حجم التداول في الربع 3 نقاط واجهة منقاري وعبد القديرحجم uarter إلى 3 نقاط واجهة الذيلية.
  5. ثم، وضخ فورا خلايا throbmbin في نفس البقع. سوف خليط من الخلايا والخلايا الفيبرينوجين الثرومبين داخل الموقع الآفة تشكل هلام الليفين لعقد الخلايا في موقع الآفة وسوف الكوكتيلات عامل النمو دعم بقاء الخلايا. يتم حقن الخلايا باستخدام الماصات الزجاج سحبت متصلة PicoSpritzer (العامة صمام، وشركة).
  6. زرع NSCs الإنسان المثقف 21 في نفس الإجراء الموصوف أعلاه، واستخدام الليفين وعامل النمو زجاجات مصنوعة من الكواشف الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح وضع العلامات GFP immunohistological أن NSCs الفئران المطعمة معلق في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (تفتقر إلى المصفوفة الليفين وعوامل النمو) نجا ضعيفا في الموقع transection T3، ربط فقط إلى الهامش الآفة / المضيف وترك معظم موقع الآفة فارغة دون الخلايا المطعمة (الشكل 2A). تحسين بقاء NSCs عندما شارك المطعمة مع المصفوفات الليفين وحدها، ولكن لم الكسب غير المشروع لا تملأ تماما حتى تجويف آفة كبيرة (لا تظهر البيانات). لذلك، نحن جزءا لا يتجزأ من NSCs في المصفوفات التي تحتوي على زجاجات الفيبرين عامل النمو لتعزيز بقائهم على قيد الحياة، وملء تجاويف آفة كبيرة والتمايز في الخلايا العصبية والدبقية بعد transection الحبل الشوكي 15-17. الطعوم إما الفئران أو NSCs الإنسان باستمرار وبشكل كامل ملء تجويف الآفة عند تقييم سبعة أسابيع بعد التطعيم-18 (أرقام 2B-C).

أجرينا دراسة بالطبع الوقت لدراسة مبكرةالبقاء على قيد الحياة وملء تجويف الآفة بعد تطعيم NSCs جزءا لا يتجزأ من مصفوفات الليفين مع الكوكتيلات عامل النمو. وكشف التحليل النسيجي التي GFP التعبير عن NSCs نجا جيدا 24 ساعة بعد زرع (أرقام 3A-B). وNSCs المطعمة أصبحت تدريجيا أكثر كثافة مع مرور الوقت لملء تماما تجويف آفة مقطوع بحلول الأسبوع الأول بعد زرع ربما يرجع ذلك إلى انتشار 21 (أرقام 3C-H). بالإضافة إلى ذلك، المطعمة NSCs مندمجا بشكل جيد في واجهة المضيف / الآفة ويبدو للحد من مناطق مناعية GFAP على هامش تجويف الآفة (الشكل 3).

جزء من NSCs المطعمة متباينة في الخلايا العصبية NeuN، معربا عن بعد سبعة أسابيع زرع (أرقام 4A-B). بالإضافة إلى ذلك، مددت الخلايا العصبية في النخاع الشوكي المستمدة من الكسب غير المشروع أعداد كبيرة من محاور عصبية في الحبل الشوكي المضيف في اتجاهات منقاري والذيلية على حد سواء لمسافات طويلة 18 < / sup> في (الشكل 4C). المطعمة المحاور المستمدة تمديد rostrally ونحو caudally من خلال كل من المادة البيضاء والمادة الرمادية في الحبل الشوكي المضيف (أرقام 4D-E).

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي التجريبية والوقت الخط. أ) رسم تخطيطي مقتبس من بوبوفيتش 22 (خلية 2012) يوضح زرع الخلايا الجذعية العصبية مع هلام الليفين التي تحتوي على عامل النمو كوكتيل في الحبل الشوكي مقطوع تماما. B) خط الزمن التجريبية. التحليلات السلوكية وelectriophysiological لا يمكن أن يؤديها بعد التطعيم وقبل الخلية الارواء. الوقت البقاء على قيد الحياة من الموضوعات يمكن أن تكون متغيرة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

ntent "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 2
. الرقم 2 البقاء على قيد الحياة وملء الخلية الجذعية العصبية الطعوم في T3 مواقع Transection كاملة يوضح GFP وGFAP الفلورسنت immunolabeling في أقسام أفقية (A) بقاء الفقراء من الفئران E14 NSCs (الأخضر) إعادة علقت في برنامج تلفزيوني تفتقر إلى عوامل النمو والليفين المصفوفة؛ ق) بقاء ممتاز وملء كاملة من تجويف آفة عندما كانت جزءا لا يتجزأ (B) الفئران أو (C) NSCs الإنسان في المصفوفات التي تحتوي على زجاجات الفيبرين عامل النمو. والمطعمة الخلية في مواقع transection T3 لمدة 7 أسابيع. شريط الحجم، 310 ميكرون. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

6.5in "سرك =" / files/ftp_upload/50641/50641fig3highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الرقم 3. بقاء الكسب غير المشروع في نقاط زمنية في وقت مبكر. AB) GFP وGFAP مزدوجة عرض immunolabeling البقاء وتوزيع NSCs الفئران المطعمة في الموقع transection، 1 يوم آخر غرس في مصفوفة الليفين. ويظهر في منطقة محاصر A في أعلى التكبير في لوحة ب CD) بقاء الخليوي وتوزيع واضح أيضا في يوم 2 و (EF) يوم 3 بعد التطعيم. GH) بواسطة 7 أيام، وخلايا ملء موقع الآفة وهي أكثر كثافة. شريط النطاق: A، C، E، G، 300 ميكرومتر؛ B، D، F، H، 62 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 4
الشكل 4. التفاضل وثمرة من العصبية سانتالطعوم م الخليوي في T3 كاملة Transection الموقع. AB) GFP ووضع العلامات NeuN تأكيد اسعة العصبية تمايز / نضوج الفئران المطعمة الخلايا الجذعية العصبية بعد 7 أسابيع التطعيم. C) GFP ويكشف NeuN immunolabeling أن العصبية ترقيع الخلايا الجذعية، معربا عن GFP توسيع أعداد كبيرة من محاور عصبية في الحبل الشوكي المضيف منقاري و الذيلية إلى موقع transection (الذيلية معروضة)، أسبوعين آخر التطعيم. DE) التكبير العالي من المناطق محاصر من لوحة C تبين أن مناطق واسعة من الحبل الشوكي المضيف تحتوي على التوقعات المستمدة من الكسب غير المشروع في كل محور عصبي المادة البيضاء والمادة الرمادية. شريط النطاق: AB، 62 ميكرومتر؛ C، 700 ميكرومتر؛ دي، 62 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واحدة من العقبات الرئيسية لمجلس الأمن القومي في زرع النخاع الشوكي المصاب هو البقاء على قيد الحياة الفقيرة في مركز الآفة. يمكن أي ثغرات أو تجاويف في موقع الآفة يحتمل أن تقلل أو تضعف تشكيل التبديلات العصبية الوظيفية بين محاور عصبية فوق الشوك وفصل شرائح الحبل الشوكي أسفل الإصابة. بالإضافة إلى ذلك، بقاء الفقراء من NSCs المطعمة قد تؤثر على اندماجهم مع الأنسجة المضيف، وبالتالي الحد من التواصل بين الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية المطعمة المضيف. الآليات المحتملة لتفسير فقدان الخلية وتشمل البيئة السامة للخلايا التي أنشأتها اصابات النخاع الشوكي الحاده، تنكس الثانوية من الحبل الشوكي المضيف، وعدم كفاية الأوعية الدموية في المنطقة أصيب 4.

وقد استخدمت الليفين لتسليم الخلايا والمخدرات وعوامل النمو في نماذج تجريبية مختلفة والتطبيقات السريرية، لأنه يمكن الاحتفاظ بها الخلايا والجزيئات عندما يصبح بلمرة 23. أظهرت دراسة سابقة أن الليفين الإنسان تسربيمكن أن تكون بمثابة biomatrix لتعزيز تجدد المحاور في subtotally مقطوع الحبل الشوكي دون انتزاع الآثار السلبية للكشف 24. كنا سابقا المصفوفات الليفين لتضمين نخاع العظم الخلايا اللحمية للزرع في الحبل الشوكي المصاب المزمن 17. الخلايا المطعمة نجا جيدا في موقع الآفة المزمنة ومتكاملة بشكل جيد مع المضيف حمة الحبل الشوكي 17. وبالتالي، فإننا تمديد استخدام الليفين لتضمين NSCs للزرع في مواقع آفة كبيرة مفتوحة في الحبل الشوكي مقطوع. على الرغم من بقاء NSCs المطعمة تحسنت مع الليفين، ظل بقاء NSCs المطعمة متغير نوعا ما والمطعمة NSCs نادرا ما ملأ تماما تجويف آفة كبيرة.

لذا أضفنا مزيج من عوامل النمو في محاولة لتعزيز بقاء وانتشار NSCs في موقع الآفة. وقد تبين أن عوامل النمو في العديد من الدراسات لدعم NSCs في المختبر 25. مبادرة الخوذ البيضاءلو إضافة عوامل النمو لثقافات NSCs يمكن تغيير مصيرهم، ونحن لم نوعيا كشف عن تغير واضح في كثافة الخلايا العصبية عندما الكوكتيلات عامل النمو تضاف إلى الكسب غير المشروع مقارنة مع تلك نجا جزئيا الكسب غير المشروع دون عوامل النمو. تحليل أكثر تفصيلا ضروري قبل يمكننا أن نقدر على وجه اليقين تأثير الكوكتيلات عامل النمو على مصير الخلية. أثناء تطوير العصبية العادية، وبقاء ونمو الخلايا العصبية تعتمد على عوامل عصبية التي غالبا ما صدر عن الهدف دليل الأنسجة نمو محور عصبي، وفي بعض الحالات، يؤثر بقاء الخلايا العصبية 26.

وقد استخدمت مماثلة ولكن أبسط الكوكتيلات عامل النمو من قبل مجموعات أخرى لتعزيز بقاء وتمايز NSCs سواء في المختبر والمجراة 15،16. وقد أسفرت هذه الجهود عموما في مجلس الأمن القومي البقاء على قيد الحياة أقل شمولا من النهج القائم على عامل متعددة التي اعتمدناها. والخطوة التالية الأساسية في هذا التطورالجهد لتضييق قائمة عوامل النمو في الكوكتيل التي لا غنى عنها لدعم مجلس الأمن القومي البقاء على قيد الحياة، وهو جهد جار. فمن الممكن تماما أن عدد محدود من عوامل النمو ستدعم درجة متساوية من بقاء الكسب غير المشروع، وهو الاكتشاف الذي من شأنه تبسيط هذا المنهج التجريبي والترجمة إمكاناتها لدراسات الإنسان.

بالإضافة إلى استخدام المصفوفات الليفين والكوكتيلات عامل النمو، فإن نجاح التطعيم في الجسم الحي إلى موقع الآفة شديدة قد تعتمد على عوامل ميكانيكية في موقع الآفة. نحن نبذل كل جهد للحفاظ على سلامة غشاء الجافية رقيقة للغاية أن يعتلي الحبل الشوكي القوارض بعد الآفات والتطعيم، وذلك في محاولة للاحتفاظ الخلايا المطعمة ميكانيكيا في موقع الآفة. وهكذا، ونحن نبذل جهودا متأنية والدؤوب لتحسين تعبئة الخلية ثابت من موقع الآفة. بدون هذه الجهود متعددة، ملء الكسب غير المشروع غير مكتملة. هذه التقنيات تتطلب الممارسين واسعةم.

في محاولة لتعليم هذه التقنية للآخرين، حددنا بعض التحديات. إذا تم حقن الخلايا في النخاع الشوكي المضيف بدلا من تجويف الآفة، ثم الخلايا قد تفرق تفضيلي في الدبقية. في هذه الحالة، يتم تقليل عدد من المحاور الناشئة إلى حد كبير. إذا لم تتم عناية كبيرة والاجتهاد لملء تجويف الآفة باستخدام تقنيات متعددة والنهج وصفها في الفقرات السابقة، وبقاء الخلية هو أقل اتساقا والاستجابات البيولوجية، بما في ذلك ثمرة محوار، محدودة. وبالتالي، فمن الضروري أن يكرس وقتا كبيرا، والاجتهاد وتقنية دقيقة لاستخدام هذه الأساليب بنجاح. مرة واحدة يتم الحصول على التقنيات، وكانت النتائج متسقة للغاية من الحيوان الى الحيوان، مما أسفر عن القدرة على دراسة الخصائص البيولوجية ملحوظا من هذه NSCs في مواقع العصبي المركزي نظام الآفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

نشكر مركز بحوث الموارد الجرذ و، جامعة ميسوري، كولومبيا، ميزوري، لتوفير الفئران GFP؛ Neuralstem شركة لتوفير الخلايا الجذعية العصبية البشرية. وأيد هذا العمل من قبل إدارة المحاربين القدامى، المعاهد الوطنية للصحة (NS09881)، منظمة البحوث الشوكي الكندي، ومؤسسة نيلسون H. كريغ، وبرنارد والثقة آن سبيتزر الخيرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen (rat) Sigma F6755-25MG 2 hr at 37 °C to dissovle
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat) Sigma T5772-100UN Dissovle in 10 mM CaCl2
Stock Concentration: 50 U/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human) Sigma F0291 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine) Sigma E1257 (0.1 mg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human) Peprotech 452-02 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human) Peprotech 452-03 (1 mg) Stock Concentration: 1,000 ng/μl
Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat) Sigma G1401 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse) Sigma I8779 (50 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human) Sigma F5542 (25 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human) Sigma P3076 (10 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human) Sigma H9661 (5 μg) Stock Concentration: 200 ng/μl
Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170 Sigma M6690 (25 mg) Stock in DMSO
Stock Concentration: 1 mM
Final Concentration: 50 μM
PBS Millipore BSS-1005-B Stock Concentration: 1x
Final Concentration: 1x
DMSO Sigma D2650
Ketamine Putney 26637-411-01 40-80 mg/kg
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine Lloyd 0410, 2.5-8 mg/ml
Stock Concentration: 100 mg/ml
Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine Butler 003845 0.5-4 mg/ml
Stock Concentration: 10 mg/ml
Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine Healthpets BET16OZ
Ringers Abbott 04860-04-10 2-3 ml/inj
Banamine Schering-Plough 0061-0851-03 2.5-5 mg/kg
Stock Concentration: 50 mg/ml
Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin Sandoz 0781-3404-85 80-100 mg/kg
Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH Sigma L4513 200 μg/kg
Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS Gibco 14175-096
Trypsin Gibco 25200056 Stock Concentration: 0.25 %
Final Concentration: 0.125 %
DMEM Gibco 11995073
FBS Gibco 16000044 Stock Concentration: 100 %
Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium Gibco 21103049
B27 Gibco 17504044 Stock Concentration: 100x
Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
  2. Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
  3. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
  4. Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
  5. Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
  6. Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
  7. Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
  8. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
  9. Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
  10. Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
  11. Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
  12. Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
  13. Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
  14. Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
  15. Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
  16. Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
  17. Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
  18. Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
  19. Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
  20. Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
  21. Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
  22. Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
  23. Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
  24. Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
  25. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  26. Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).

Tags

علم الأعصاب، العدد 89، وأمراض الجهاز العصبي، والجروح والإصابات، والعوامل البيولوجية، والمداواة، والعمليات الجراحية، والخلايا الجذعية العصبية، وزرع، واصابات الحبل الشوكي، الفيبرين، عوامل النمو
تعزيز بقاء وتمايز الخلايا الجذعية العصبية مع الليفين وعامل نمو الكوكتيلات بعد إصابة الحبل الشوكي الشديدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, P., Graham, L., Wang, Y., Wu,… More

Lu, P., Graham, L., Wang, Y., Wu, D., Tuszynski, M. Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (89), e50641, doi:10.3791/50641 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter